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　　卡他莫拉菌(moraxellacatarrhalis,MC)為革蘭陰性雙球菌,原屬奈瑟菌屬(Neisseriacatarrhalis,NC),Catlin在1970年將此菌分類為布蘭漢菌屬(Branhamellacatarrhalis,BC),1984年在伯杰分類細(xì)菌學(xué)手冊(cè)中被列為莫拉菌屬的布蘭漢亞屬(subgenusbranhamella)。MC是人類上呼吸道的常居菌種,為條件致病菌。該菌可引起人類的多種感染,可累及全身。國(guó)外資料顯示,MC在成人下呼吸道感染及兒童肺炎、中耳炎等標(biāo)本中的分離率,僅次于流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌列第三位。因此,快速鑒定MC具有重要的臨床意義。我們用3-乙酰吲哚紙片法檢測(cè)乙酰酯酶,快速鑒定MC。并測(cè)定4種β內(nèi)酰胺抗生素的復(fù)方制劑及亞胺培南/西司他丁對(duì)β內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性MC的抗菌活性。報(bào)告如下。

　　材料和方法

　　一、材料

　　1.菌株來(lái)源:MC(228株)、淋病奈瑟菌(15株)、腦膜炎奈瑟菌(3株)、奈瑟菌屬(153株)、莫拉菌亞屬(24株)、博德特菌屬(6株)、不動(dòng)桿菌屬(138株)均為臨床分離株。標(biāo)準(zhǔn)菌株MC9602,9707,0101為全國(guó)臨床檢驗(yàn)中心質(zhì)控菌株,MC的ATCC25238、解乳糖奈瑟菌ATCC23970、淡黃色奈瑟菌ATCC14799、腦膜炎奈瑟菌ATCC13102、金黃色葡萄球菌ATCC25923,29213為本實(shí)驗(yàn)室菌庫(kù)保存。

　　2.培養(yǎng)基:5%羊血瓊脂培養(yǎng)基(SBA),5%兔血巧克力瓊脂培養(yǎng)基(RChoc),5%羊血巧克力瓊脂培養(yǎng)基(SChoc),含50μg/ml萬(wàn)古霉素的兔血巧克力瓊脂培養(yǎng)基(Choc-V),淋病奈瑟菌培養(yǎng)基(NGA),MH培養(yǎng)基(MHA),5%羊血MH培養(yǎng)基(MHB),腦心瓊脂培養(yǎng)基(BCA),營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NUA),中國(guó)藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(ZLA),DNA瓊脂培養(yǎng)基均為本室自制。

　　3.試劑:蛋白胨、DNA瓊脂粉、MH瓊脂粉、VITEK-(NHI和GNI)鑒定試卡購(gòu)自生物梅里埃公司。萬(wàn)古霉素為美國(guó)禮來(lái)公司產(chǎn)品,鹽酸四甲基對(duì)苯二胺、3-乙酰吲哚購(gòu)自SIGMA公司,Nitrocefin購(gòu)自O(shè)XOID公司(英國(guó))。氧化酶紙片(1%鹽酸四甲基對(duì)苯二胺溶液浸泡紙片后吹干備用),乙酰酯酶紙片(100mg/ml3-乙酰吲哚丙酮溶液浸泡50片紙片后吹干備用),Nitrocefin紙片(12.5μg/片Nitrocefin吹干備用)。

　　4.抗生素:哌拉西林(PIPC),齊魯制藥廠產(chǎn)品;氨芐西林(AMP),華北制藥有限公司產(chǎn)品;哌拉西林/舒巴坦(PIPC/SBT)(4∶1),?？诮芡幬镅芯克邢薰井a(chǎn)品;哌拉西林/他唑巴坦(PIPC/TAZ)(8:1),美國(guó)立達(dá)公司產(chǎn)品;氨芐西林/舒巴坦(AMP/SBT)(2∶1),頭孢哌酮/舒巴坦(CFP/SBT)(1∶1),美國(guó)輝瑞公司產(chǎn)品;亞胺培南/西司他丁(IPM/CST)(1∶1),美國(guó)默沙東藥廠產(chǎn)品。

　　二、方法

　　1.菌株分離與鑒定:將可疑標(biāo)本接種于SBA和Choc-V瓊脂平板上,置5%CO2孵箱,35℃培養(yǎng)24～72h觀察結(jié)果。細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定按文獻(xiàn)進(jìn)行,分離到的菌株經(jīng)涂片革蘭染色鏡檢、觸酶、氧化酶試驗(yàn)后,用VITEK-(NHI和GNI)鑒定試卡鑒定到種。

　　2.氧化酶試驗(yàn):按文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。

　　3.DNA酶試驗(yàn):按文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。

　　4.乙酰酯酶試驗(yàn):用無(wú)菌生理鹽水將3-乙酰吲哚紙片沾濕,取待檢菌落涂在紙片上,3min內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)綠色為陽(yáng)性反應(yīng)。以MC的ATCC25238,全國(guó)臨床檢驗(yàn)中心質(zhì)控菌株9602,9707,0101作為陽(yáng)性對(duì)照。

　　5.生長(zhǎng)指數(shù)(GI)測(cè)定:取經(jīng)Rchoc平板24h培養(yǎng)的卡他莫拉菌ATCC25238菌落于2ml無(wú)菌鹽水中,制成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙?再用無(wú)菌鹽水進(jìn)行1:10連續(xù)稀釋,取10-5、10-6、10-7稀釋度菌液100μl分別接種在9種培養(yǎng)基上(Rchoc、Schoc、Choc-V、SBA、MHA、MHB、BCA、NUA、ZLA),分別置普通孵箱和5%CO2孵箱各1套,于35℃孵育24、48、72、96h,計(jì)數(shù)少于10個(gè)菌落平板上的菌落數(shù),并用游標(biāo)卡尺量出菌落直徑,求其均值(mm),再乘以此最高稀釋度的對(duì)數(shù)即得GI。

　　6.β內(nèi)酰胺酶試驗(yàn):用無(wú)菌蒸餾水將Nitrocefin紙片沾濕,取MC菌落涂在紙片上,5min內(nèi)紙片變紅色者判為β內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性。

    7.藥敏試驗(yàn):根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)1998年版標(biāo)準(zhǔn),采用瓊脂平皿二倍稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度(MIC),用多點(diǎn)接種儀定量種菌。以金黃色葡萄球菌ATCC29213為質(zhì)控菌株監(jiān)測(cè)整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程,質(zhì)控值超出范圍者,該批試驗(yàn)數(shù)據(jù)作廢,找出原因后重復(fù)試驗(yàn)。

　　結(jié)果

　　1.氧化酶試驗(yàn):228株MC、15株淋病奈瑟菌、3株腦膜炎奈瑟菌、153株奈瑟菌、24株莫拉菌、6株博德特菌氧化酶均為陽(yáng)性,138株不動(dòng)桿菌氧化酶為陰性。

　　2.DNA酶試驗(yàn):228株MC中DNA酶全為陽(yáng)性,15株淋病奈瑟菌、3株腦膜炎奈瑟菌、153株奈瑟菌、24株莫拉菌、6株博德特菌、138株不動(dòng)桿菌中DNA酶均為陰性。卡他莫拉菌對(duì)DNA酶的敏感性為100%,特異性為100%。

　　3.乙酰酯酶試驗(yàn):15株淋病奈瑟菌、3株腦膜炎奈瑟菌、153株奈瑟菌、24株莫拉菌亞屬、6株博德特菌乙酰酯酶均為陰性,138株不動(dòng)桿菌中乙酰酯酶陽(yáng)性114株(占82.6%),228株卡他莫拉菌乙酰酯酶全為陽(yáng)性。卡他莫拉菌對(duì)乙酰酯酶的敏感性為100%,特異性為75.7%。但與近緣菌(淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、奈瑟菌屬、莫拉菌亞屬)比較特異性為100%。

　　4.β內(nèi)酰胺酶:228株MC中β內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性212株,24株莫拉菌亞屬β內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性5株,15株淋病奈瑟菌、3株腦膜炎奈瑟菌、153株奈瑟菌、6株博德特菌β內(nèi)酰胺酶均為陰性。

　　5.不同培養(yǎng)基上的GI值比較:MC的ATCC25238在ZLA培養(yǎng)基上不生長(zhǎng);在MHA、BCA、NUA3種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不良,分別經(jīng)24,48,72,96h培養(yǎng),與Rchoc瓊脂培養(yǎng)基的GI值比較,差異有顯著性(P<0.05);MC的ATCC25238在Rchoc、Schoc、Choc-V、SBA、MHB5種培養(yǎng)基上經(jīng)24,48,72,96h培養(yǎng)的GI值結(jié)果比較,差異無(wú)明顯意義(P>0.05);5%CO2環(huán)境與空氣環(huán)境比較,對(duì)GI值結(jié)果影響不明顯(P>0.05)。結(jié)果如表1所示。

    6.藥敏試驗(yàn):如表2所示,PIPC、AMP、PIPC/SBT、CFP/SBT、PIPC/TAZ、AMP/SBT、IPM/CST對(duì)卡他莫拉菌的MIC50和MIC90分別為0.5,4.0,0.06,0.5,0.06,0.125,2.0,2.0μg/ml和2.0,8.0,0.25,1.0,0.25,2.0μg/ml;PIPC/SBT和PIPC/TAZ的MIC50和MIC90分別較單PIPC降低了8倍;AMP/SBTR的MIC50和MIC90較單AMP降低了32倍和4倍。

　　討論

　　MC與許多嚴(yán)重感染性疾病有關(guān),但由該菌引起的感染發(fā)病率一直難以估計(jì)。因?yàn)?MC生長(zhǎng)較緩慢,在不含血的培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)瓊脂、MH瓊脂、腦心瓊脂)上生長(zhǎng)不良,菌落及菌體形態(tài)與許多近緣菌相似,分離及鑒定較為困難。為此,提高M(jìn)C分離率已成為臨床診斷和治療MC感染所急需。國(guó)外已建立起多種檢測(cè)MC的方法,如丁酸酯酶法、MUB法、CONFIRM法及血清學(xué)檢測(cè)法等。國(guó)內(nèi)多采用DNA酶及硝酸鹽還原試驗(yàn)將MC與近緣菌相區(qū)別,方法既繁瑣又費(fèi)時(shí),結(jié)果也不易判斷。我們采用3-乙酰吲哚紙片法檢測(cè)MC產(chǎn)生的乙酰酯酶快速鑒定MC,此法操作簡(jiǎn)便,易于判斷,敏感性為100%,和近緣菌(淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、奈瑟菌屬、莫拉菌亞屬)比較特異性為100%,與DNA酶試驗(yàn)及生化鑒定結(jié)果的相關(guān)性比較均為100%。雖然不動(dòng)桿菌的乙酰酯酶陽(yáng)性率高達(dá)82.6%,但是不動(dòng)桿菌的氧化酶陰性,DNA酶試驗(yàn)陰性,在普通瓊脂及中國(guó)藍(lán)瓊脂上生長(zhǎng)良好,且菌落較MC濕潤(rùn)和光滑,稍加注意不難區(qū)別。用3-乙酰吲哚紙片法檢測(cè)MC產(chǎn)生的乙酰酯酶,3min即可出結(jié)果,成本較低,一片紙片可鑒定多個(gè)菌落,可用于可疑菌落的篩選,是臨床實(shí)驗(yàn)室快速鑒定MC的良好方法,值得推廣應(yīng)用。

　　在9種臨床實(shí)驗(yàn)室常用的瓊脂培養(yǎng)基上比較MC的生長(zhǎng)情況,試驗(yàn)結(jié)果表明,MC對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高,在不含血的MH培養(yǎng)基、腦心瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和中國(guó)藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不良或不生長(zhǎng)。在5種含血的培養(yǎng)基上MC的GI比較結(jié)果顯示,MC在巧克力瓊脂培養(yǎng)基上比在血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好,GI值比較差異無(wú)顯著性(P>0.05);MC在不同血源巧克力瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況比較,兔血稍好于及羊血(P>0.05)。為提高M(jìn)C的分離率,我們采用含50μg/ml萬(wàn)古霉素的兔血巧克力瓊脂培養(yǎng)基(加入萬(wàn)古霉素可抑制革蘭陽(yáng)性細(xì)菌的生長(zhǎng),增加了對(duì)MC的選擇性)及5%CO2條件下對(duì)MC進(jìn)行分離培養(yǎng),并將培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)到72h,分離率大有提高。

　　對(duì)228株MC的β內(nèi)酰胺酶檢測(cè)結(jié)果分析表明,其陽(yáng)性率高達(dá)93.0%,應(yīng)引起臨床醫(yī)生的重視。哌拉西林/舒巴坦、氨芐西林/舒巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦及亞胺培南/西司他丁對(duì)β內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性MC有很好的抗菌活性。在MC感染的治療中,應(yīng)選用含β內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)方制劑或用對(duì)β內(nèi)酰胺酶頭孢菌素進(jìn)行治療。MC的近緣菌(淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、奈瑟菌屬、莫拉菌亞屬等)中,β內(nèi)酰胺酶的陽(yáng)性率非常低,因此,β內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)也可作為MC與近緣菌的輔助試驗(yàn)。

　　中國(guó)微生物查詢網(wǎng)（www.family998.com）轉(zhuǎn)載自中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2003