一、背景
KASUMI-1人紅白血病傳代細(xì)胞系建立于一位急性白血病患者的外周血，KASUMI-1人紅白血病傳代細(xì)胞系髓過(guò)氧化物酶陽(yáng)性，顯示其髓性成熟的形態(tài)。增生試驗(yàn)顯示，培養(yǎng)的KASUMI-1人紅白血病傳代細(xì)胞系對(duì)IL-3、IL-6、G-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)、GM-CS(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)有響應(yīng)，但對(duì)IL-1和IL-5沒(méi)有響應(yīng)。在體外液體培養(yǎng)中分別加入二甲亞砜、G-CSF、IL-5，也沒(méi)有觀察到粒性或嗜酸性細(xì)胞的成熟。KASUMI-1人紅白血病傳代細(xì)胞系培養(yǎng)過(guò)程中，加入佛波酯可以看到誘導(dǎo)出的巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞。
KASUMI-1人紅白血病傳代細(xì)胞系具有人急性淋巴白血病細(xì)胞的典型特征，是研究人急性淋巴白血病的極佳材料。KASUMI-1人紅白血病傳代細(xì)胞系是一個(gè)帶有8：21號(hào)染色體轉(zhuǎn)位的白血病細(xì)胞株，這個(gè)轉(zhuǎn)位使得AML1基因和ETO(或稱MTG8)基因串聯(lián)，使融合基因AML1-ETO(也稱作AML1-MTG或RUNX1-CBF2T1)的表達(dá)升高，因而細(xì)胞產(chǎn)生嵌合的AML1-ETO蛋白。這個(gè)蛋白下調(diào)CEBPA mRNA、蛋白和DNA的結(jié)合活性，而這種結(jié)合對(duì)粒性白細(xì)胞的分化是極端重要的。
二、KASUMI-1人紅白血病傳代細(xì)胞系培養(yǎng)步驟
1、KASUMI-1人紅白血病傳代細(xì)胞系培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備1640培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，20%；Gluta-max（invitrogen 35050）1%；雙抗，1%。
2）注意事項(xiàng)：
a)該細(xì)胞復(fù)蘇后成活率較低，會(huì)出現(xiàn)大量死細(xì)胞和死細(xì)胞碎片，培養(yǎng)兩周后有所好轉(zhuǎn)。建議每1-2周對(duì)細(xì)胞進(jìn)行1000rpm,5mins離心，棄掉上清，加入新鮮完全培養(yǎng)液，可以去掉部分細(xì)胞碎片和顆粒。培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，收到郵寄的活細(xì)胞的用戶若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物內(nèi)有部分死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，此為正常現(xiàn)象。
b)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)有輕微聚團(tuán)，輕輕吹打開即可。當(dāng)細(xì)胞密度較大或者培養(yǎng)液變黃時(shí)，需要及時(shí)進(jìn)行半換液或者完全換液。
c)該細(xì)胞對(duì)血清質(zhì)量較為敏感，我?guī)旖ㄗh您使用進(jìn)口大品牌優(yōu)質(zhì)血清進(jìn)行培養(yǎng)。
d)請(qǐng)注意保持細(xì)胞密度在合適的范圍（3x105~3x106/ml），不能過(guò)稀。
3）KASUMI-1人紅白血病傳代細(xì)胞系培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
4）KASUMI-1人紅白血病傳代細(xì)胞系凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2、KASUMI-1人紅白血病傳代細(xì)胞系細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇KASUMI-1人紅白血病傳代細(xì)胞系細(xì)胞：將含有1mLKASUMI-1人紅白血病傳代細(xì)胞系細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）KASUMI-1人紅白血病傳代細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于KASUMI-1人紅白血病傳代細(xì)胞系貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3、按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4、將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）KASUMI-1人紅白血病傳代細(xì)胞系細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
1、KASUMI-1人紅白血病傳代細(xì)胞系細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入2ml完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2、1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。明舟生物（mingzhoubio）按每個(gè)凍存管細(xì)胞數(shù)目大于1X106個(gè)細(xì)胞凍存。
3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
KASUMI-1人紅白血病傳代細(xì)胞系可以用于地西他濱誘導(dǎo)Kasumi-1白血病細(xì)胞G2/M期阻滯和凋亡的作用機(jī)制研究：
為了明確原發(fā)性AML中甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)和DNA甲基化情況,本研究首先利用TCGA癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)及DNA甲基化修飾情況進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNMT3a在人AML中表達(dá)上調(diào),DNA甲基化修飾增多。接下來(lái),添加DAC培養(yǎng)原發(fā)性AML細(xì)胞系Kasumi-1,并檢測(cè)其生物學(xué)行為,結(jié)果顯示,DAC抑制Kasumi-1細(xì)胞增殖、影響細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證DAC對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用,用RT-q PCR方法檢測(cè)調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)控因子的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)p21、p53、CDC25A、CDC2、CCNB1、WEE1的表達(dá)均上調(diào),表明G2/M期阻滯可能通過(guò)p21/cdc25C/cdc2/cyclin B基因表達(dá)的改變而抑制Kasumi-1細(xì)胞的增殖。
為了研究DAC處理導(dǎo)致Kasumi-1細(xì)胞周期阻滯G2/M期的機(jī)制,首先,利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)UALCAN系統(tǒng)在線分析,發(fā)現(xiàn)在AML患者細(xì)胞中和DNMT3a存在負(fù)調(diào)控關(guān)系的基因共541個(gè),其中鈣結(jié)合蛋白S100A11與DNMT3a存在顯著的負(fù)調(diào)控關(guān)系,其在AML中低表達(dá)但不顯著。
進(jìn)一步對(duì)DAC處理的Kasumi-1細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,并將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中表達(dá)上調(diào)的基因和TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的AML較正常骨髓DNA甲基化程度顯著降低的基因群,進(jìn)行交叉分析,發(fā)現(xiàn)204個(gè)基因在AML骨髓和Kasumi-1細(xì)胞中均發(fā)生顯著變化,其中包含絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶ATM。
進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),DAC處理后ATM和P53的表達(dá)顯著上調(diào),顯示DAC可能通過(guò)改變p53和ATM的表達(dá)而促進(jìn)Kasumi-1細(xì)胞G2/M期阻滯和凋亡的作用。
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