一、背景
人胚胎膀胱組織來源細(xì)胞是分離自胚胎膀胱組織的原代細(xì)胞，主要用于胚胎膀胱組織細(xì)胞的相關(guān)細(xì)胞學(xué)研究。
二、培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇細(xì)胞:將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中,加入約8ml培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜)。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)細(xì)胞傳代:如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基,輕輕打勻后吸出,在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3)細(xì)胞凍存:待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí),可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為類;
1.細(xì)胞凍存時(shí),棄去培養(yǎng)基后,PBS清洗一遍后加入1ml胰酶,細(xì)胞變圓脫落后,加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化,可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO,輕輕混勻,DMSO終濃度為10%,細(xì)胞密度不低于1x106/ml,每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液,注意凍存管做好標(biāo)識。
3.將凍存管置于程序降溫盒中,放入-80度冰箱,2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
人胚胎膀胱組織來源細(xì)胞可以用于干細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Oct4在人膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及對人膀胱癌EJ細(xì)胞生物學(xué)的影響：
觀察干細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Oct4在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá),并探討Oct4基因沉默對人膀胱癌EJ細(xì)胞生物學(xué)的影響,探討Oct4基因作為膀胱癌基因治療靶點(diǎn)的可行性和有效性。
方法：分別用免疫組化和實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測74例膀胱癌組織和32例癌旁組織及24例正常膀胱組織病理標(biāo)本中的Oct4表達(dá);并將人膀胱癌EJ細(xì)胞,常規(guī)分為空白對照組、陰性對照組和實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。體外化學(xué)合成Oct4基因序列特異性小干擾RNA(siRNA),脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人膀胱癌細(xì)胞株EJ細(xì)胞;采用RT-PCR和Western印跡方法分別檢測特異性siRNA對Oct4基因在mRNA和蛋白水平上沉默效果;轉(zhuǎn)染后采用MTT法檢測siRNA對細(xì)胞增殖的作用;AO/EB熒光染色法檢測其凋亡情況;用細(xì)胞劃痕和Transwell試驗(yàn)體外檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力。
結(jié)果：免疫組化顯示Oct4在膀胱癌組織的表達(dá)明顯高于癌旁組織和正常膀胱組織,陽性表達(dá)率分別為83.78%、21.87%、0%,各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Oct4在膀胱癌不同病理分級中的陽性表達(dá)率分別為G1組66.67%、G2組87.50%、G3組100%,在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率為92.3%,79.1%,隨著病理分級的升高和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn),Oct4表達(dá)水平逐漸升高,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但不同分期的膀胱癌組織中Oct4表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示Oct4在膀胱癌組織中的表達(dá)是癌旁組織的的2.0倍,是正常膀胱組織的3.41倍,各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但不同分期的膀胱癌組織中Oct4表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);成功轉(zhuǎn)染Oct4-siRNA的膀胱癌EJ細(xì)胞,RT-PCR及Western blot分別顯示Oct4mRNA和蛋白表達(dá)在相應(yīng)的癌細(xì)胞中明顯下降;與陰性對照組比較,細(xì)胞增殖明顯抑制(P<0.05);同時(shí)細(xì)胞凋亡率增加(52.73%比11.7%);RNA干擾組明顯抑制EJ細(xì)胞遷移力和侵襲力(15.34±1.85比63.07±1.73)。
結(jié)論：Oct4的表達(dá)與膀胱癌的分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)但與臨床分期無關(guān),Oct4的過高表達(dá)可能在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用;Oct4-siRNA可以有效地抑制膀胱癌EJ細(xì)胞Oct4基因的表達(dá),從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞遷移和侵襲,Oct4-siRNA有效的調(diào)控EJ細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司的微生物菌種查詢網(wǎng)提供微生物菌種保藏、測序、購買等服務(wù),是中國微生物菌種保藏中心的服務(wù)平臺，并且是集微生物菌種、菌種,ATCC菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基為一體的大型微生物查詢類網(wǎng)站，自設(shè)設(shè)備及技術(shù)的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶來詢！