一、背景
NCI-H2087人非小細(xì)胞肺腺癌貼壁細(xì)胞系該細(xì)胞是1988年11月從一名69歲白人男性（60年煙齡）非小細(xì)胞性肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中分離得到的。
二、NCI-H2087人非小細(xì)胞肺腺癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇NCI-H2087人非小細(xì)胞肺腺癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）NCI-H2087人非小細(xì)胞肺腺癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將NCI-H2087人非小細(xì)胞肺腺癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）NCI-H2087人非小細(xì)胞肺腺癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為類；
1、NCI-H2087人非小細(xì)胞肺腺癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2、4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
NCI-H2087人非小細(xì)胞肺腺癌貼壁細(xì)胞系可以用于GPRIN1基因在非小細(xì)胞肺癌中的作用及機(jī)制的研究：
探討GPRIN1基因在NSCLC中的表達(dá)情況,分析其與NSCLC患者臨床病理特征及生存、預(yù)后的相關(guān)性。同時研究GPRIN1基因?qū)SCLC細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移、侵襲及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響。另外,構(gòu)建NSCLC裸鼠異種移植瘤模型,檢測GPRIN1對裸鼠體內(nèi)移植瘤生長的影響,進(jìn)一步探討其在NSCLC中的作用機(jī)制。
研究方法第一部分：
1、基于前期利用TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)陣列分析獲得的GPRIN1基因表達(dá)與肺腺癌患者臨床特征及生存預(yù)后關(guān)系相關(guān)數(shù)據(jù)。
2、選取100例非小細(xì)胞肺癌石蠟包埋組織標(biāo)本及40例癌旁正常肺組織標(biāo)本制成組織芯片。
3、通過免疫組化染色檢測100例NSCLC組織及40例癌旁正常肺組織中GPRIN1的表達(dá)情況。
4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析GPRIN1在NSCLC組織及癌旁正常肺組織中的表達(dá)差異。
5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析GPRIN1表達(dá)與NSCLC患者的年齡、性別、吸煙史、TNM分期、組織分化等臨床病理特征的相關(guān)性。
6、根據(jù)NSCLC患者的隨訪資料,分析GPRIN1表達(dá)與患者生存預(yù)后之間的相關(guān)性。
第二部分：
1、體外培養(yǎng)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(A549、NCI-H209、NCI-H460、Calu-1、NCI-H2087)和正常肺上皮細(xì)胞系(BEAS2B)。
2、通過實(shí)時熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測各組細(xì)胞系中GPRIN1基因的表達(dá)情況。
3、通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western-blot)檢測各組細(xì)胞系中GPRIN1蛋白的表達(dá)情況。
4、構(gòu)建過表達(dá)GPRIN1的細(xì)胞系和低表達(dá)GPRIN1的細(xì)胞系,同時構(gòu)建陰性對照組。
5、通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(CCK8)檢測敲降或過表達(dá)GPRIN1對NSCLC細(xì)胞增殖能力的影響。
6、通過平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測敲降或過表達(dá)GPRIN1對NSCLC細(xì)胞克隆形成能力的影響。
7、通過Transwell細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測GPRIN1的敲降或過表達(dá)對NSCLC細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。
8、通過Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測GPRIN1對EMT中相關(guān)因子E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表達(dá)的影響。
第三部分：
1、采用慢病毒載體構(gòu)建GPRIN1敲除、過表達(dá)及其相應(yīng)對照組的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。
2、將轉(zhuǎn)染后的A549、Calu-1細(xì)胞分別接種各組裸鼠皮下,構(gòu)建裸鼠皮下成瘤模型。
3、每周使用游標(biāo)卡尺測量并記錄各組裸鼠腫瘤長徑及短徑,計(jì)算腫瘤體積;并于裸鼠處死后完整剝?nèi)∧[瘤進(jìn)行稱重。
4、通過免疫組化法檢測裸鼠皮下移植瘤中Ki-67蛋白及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
研究結(jié)果：
1、對100例NSCLC組織中GPRIN1蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行免疫組化染色分析顯示,GPRIN1蛋白主要定位于NSCLC細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。
2、GRPIN1蛋白在100例NSCLC組織中的高表達(dá)率為65%(65/100);在30例正常肺組織中的高表達(dá)率為27.5%(11/40)。表明GPRIN1蛋白在NSCLC中的表達(dá)水平高于正常的肺組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
3、GPRIN1蛋白高表達(dá)與NSCLC患者的腫瘤分化程度相關(guān)(P<0.05),與NSCLC患者的性別、年齡、吸煙狀況、T分期、N分期、M分期及TNM分期無明顯相關(guān)性(P>0.05)。表明GPRIN1表達(dá)水平越高,則腫瘤組織分化程度越低。
4、GPRIN1蛋白的表達(dá)水平升高預(yù)示NSCLC患者有較短總生存時間,提示高表達(dá)GPRIN1與不良預(yù)后相關(guān)(P=0.004)。
5、單因素Cox回歸分析顯示:GPRIN1表達(dá)水平、N分期、M分期、TNM分期與NSCLC患者的總生存時間密切相關(guān)(P<0.05),是NSCLC患者的不良預(yù)后因素。多因素Cox回歸分析顯示:GPRIN1表達(dá)水平、TNM分期均是NSCLC患者獨(dú)立不良預(yù)后因素(P<0.05)。
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