一、背景
NCI-H2227人小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系是1989年8月從一名54歲白人男性小細(xì)胞肺癌皮膚轉(zhuǎn)移灶中分離得到的細(xì)胞系。
二、NCI-H2227人小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)條件
1、NCI-H2227人小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基（不含Hepes）+10%胎牛血清+1%雙抗+800ng/ml Taxol
2、溫度：37.0°C
3、氣體:空氣95%，CO2 5%
三、NCI-H2227人小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系復(fù)蘇操作要點(diǎn)
1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個(gè)15mL無(wú)菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。
2）將凍存NCI-H2227人小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)完全解凍，使細(xì)胞能盡快通過(guò)最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細(xì)胞)避免引起污染。
3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。
4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。
5）將NCI-H2227人小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
6）第二天觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過(guò)2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
四、應(yīng)用
NCI-H2227人小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系可用于小細(xì)胞肺癌細(xì)胞懸浮和貼壁生長(zhǎng)異質(zhì)性與化療耐藥相關(guān)性的研究：
NCI-H2227人小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系可以用于小細(xì)胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)是一種高級(jí)別的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤,具有進(jìn)展快及早期轉(zhuǎn)移等特征。SCLC早期對(duì)化療敏感,但往往會(huì)形成耐藥復(fù)發(fā)。值得注意的是,血液系統(tǒng)惡性腫瘤往往對(duì)化療敏感,而實(shí)體瘤則更為耐藥,兩者最明顯的區(qū)別在于細(xì)胞形態(tài)學(xué)的不同。血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng),實(shí)體瘤細(xì)胞大多為貼壁生長(zhǎng),這提示腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)差異與化療耐藥之間存在關(guān)聯(lián)。
此外,SCLC來(lái)源的細(xì)胞系其生長(zhǎng)模式具有明顯的異質(zhì)性,但其形成及與化療耐藥的聯(lián)系仍不清楚。
研究方法：通過(guò)生物信息學(xué)進(jìn)行pan-cancer分析,對(duì)腫瘤細(xì)胞系懸浮、貼壁生長(zhǎng)狀態(tài),以及不同生長(zhǎng)狀態(tài)所涉及的分子機(jī)制進(jìn)行分析。然后對(duì)所有肺癌細(xì)胞進(jìn)行pan-lung cancer分析,比較SCLC與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)之間以及不同形態(tài)的SCLC細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因及涉及的信號(hào)通路。再對(duì)腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)模式與化療耐藥進(jìn)行相關(guān)性分析,找出與細(xì)胞形態(tài)之間最具相關(guān)性的基因或通路。
然后使用基因改造小鼠模型進(jìn)一步驗(yàn)證。利用小分子高通量篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)克服SCLC化療耐藥的相應(yīng)通路的候選抑制劑,并且使用SCLC移植瘤模型從體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
研究結(jié)果：生信分析結(jié)果顯示,貼壁生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞中PI3K/AKT/m TOR信號(hào)通路激活,而且粘附生長(zhǎng)的細(xì)胞較懸浮細(xì)胞對(duì)化療更不敏感。此外,對(duì)SCLC細(xì)胞內(nèi)部之間的分析顯示,SCLC具有明顯的形態(tài)學(xué)差異,其貼壁細(xì)胞中PI3K/AKT/m TOR信號(hào)通路也處于激活狀態(tài)而且與其耐藥相關(guān)。在過(guò)表達(dá)EGFR激活PI3K/AKT/m TOR通路后,懸浮生長(zhǎng)的SCLC細(xì)胞出現(xiàn)向貼壁轉(zhuǎn)化的趨勢(shì),且對(duì)化療藥物的處理相對(duì)不敏感。
使用PI3K/AKT/m TOR通路的小分子抑制劑庫(kù)在SCLC細(xì)胞中進(jìn)行篩選,貼壁且耐藥的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的敏感性,而且PI3K/AKT/m TOR通路抑制劑GSK2126458聯(lián)合化療藥物在細(xì)胞及體內(nèi)均發(fā)揮協(xié)同抗瘤的作用。
結(jié)論：貼壁或半貼壁生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞相較于懸浮細(xì)胞系PI3K/AKT/m TOR通路激活,并且對(duì)化療藥物更為耐受。PI3K/AKT/m TOR通路激活可促進(jìn)懸浮SCLC細(xì)胞系向貼壁轉(zhuǎn)化且增加其化療耐藥性。此外,PI3K/AKT/m TOR通路抑制可克服貼壁生長(zhǎng)SCLC細(xì)胞的耐藥,并且與EP具有協(xié)同作用。
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