一、背景
小鼠淋巴瘤細(xì)胞(NK靶細(xì)胞)源自Mo-MuLV誘導(dǎo)的A/Sn小鼠淋巴瘤。細(xì)胞對NK細(xì)胞的作用敏感，可用于NK細(xì)胞活性檢測。鼠痘病毒陰性。
二、小鼠淋巴瘤細(xì)胞(NK靶細(xì)胞)培養(yǎng)步驟
1、復(fù)蘇小鼠淋巴瘤細(xì)胞(NK靶細(xì)胞)：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2、小鼠淋巴瘤細(xì)胞(NK靶細(xì)胞)傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對于小鼠淋巴瘤細(xì)胞(NK靶細(xì)胞)，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
3、小鼠淋巴瘤細(xì)胞(NK靶細(xì)胞)凍存：
（1）細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；
（2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；
（3）用適量的凍存液重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；
（4）先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃1.5h，然后將其移入-80℃
三、應(yīng)用
小鼠淋巴瘤細(xì)胞(NK靶細(xì)胞)可以用于STIP1蛋白參與P2X7受體介導(dǎo)的小鼠淋巴瘤細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移：
為了進(jìn)一步闡明P2X7R參與淋巴瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的機(jī)制,在前期實(shí)驗(yàn)中,使用沉默了P2X7R的小鼠淋巴瘤細(xì)胞P388D1建立淋巴瘤淋巴道轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型,P388D1在小鼠體內(nèi)成瘤,并發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移。然后采用蛋白質(zhì)組學(xué)手段對轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的蛋白質(zhì)表達(dá)情況進(jìn)行分析,篩選出了STIP1蛋白,發(fā)現(xiàn)當(dāng)P2X7R的表達(dá)被抑制后,STIP1也隨之顯著降低。
為了研究STIP1蛋白是否參與了P2X7R介導(dǎo)的淋巴瘤淋巴道轉(zhuǎn)移過程,我們?nèi)藶橐种芐TIP1蛋白在淋巴瘤細(xì)胞株中的表達(dá),探討STIP1蛋白在淋巴瘤淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用。方法:首先,采用RT-PCR及Western Blot方法檢測小鼠淋巴瘤細(xì)胞P388D1和L1210中P2X7R和STIP1表達(dá);其次,使用STIP1干擾慢病毒去感染P388D1和L1210細(xì)胞,檢測感染效率;再次,采用RT-PCR及Western Blot方法檢測P388D1和L1210細(xì)胞經(jīng)過STIP1干擾慢病毒感染后,STIP1蛋白表達(dá)的抑制情況;最后,將STIP1表達(dá)被抑制的淋巴瘤細(xì)胞P388D1和L1210注射到小鼠足墊部位,建立淋巴道轉(zhuǎn)移模型的,觀察STIP1的抑制對淋巴瘤轉(zhuǎn)移能力以及對小鼠生存時(shí)間的影響。
結(jié)果：P2X7R和STIP1在小鼠淋巴瘤細(xì)胞P388D1和L1210中表達(dá),STIP1干擾慢病毒可以抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞P388D1和L1210中STIP1的表達(dá)。STIP1表達(dá)被抑制的P388D1和L1210細(xì)胞與STIP1未被抑制的細(xì)胞相比,其向外周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的能力顯著降低,同時(shí)當(dāng)STIP1的表達(dá)被抑制后,小鼠的生存明顯時(shí)間延長。
結(jié)論：抑制STIP1可以顯著降低淋巴瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力,STIP1參與了淋巴瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的過程。
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