一、背景
LN-18人神經(jīng)膠質(zhì)瘤貼壁細胞系簡稱膠質(zhì)瘤，是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的腫瘤，故亦稱神經(jīng)外胚層腫瘤或神經(jīng)上皮腫瘤。腫瘤起源于神經(jīng)間質(zhì)細胞，即神經(jīng)膠質(zhì)、室管膜、脈絡(luò)叢上皮和神經(jīng)實質(zhì)細胞，即神經(jīng)元。
腦腫瘤中膠質(zhì)細胞瘤發(fā)病率最高，約占40.49%，綜合發(fā)病年齡高峰在30-40歲，或10-20歲。大腦半球發(fā)生的膠質(zhì)瘤約占全部膠質(zhì)瘤的51.4%，以星形細胞瘤為最多，其次是膠質(zhì)細胞瘤和少枝膠質(zhì)細胞瘤，腦室系統(tǒng)也是膠質(zhì)瘤較多的發(fā)生部位，占膠質(zhì)瘤總數(shù)的23.9%，主要為管膜瘤，髓母細胞瘤，星形細胞瘤，小腦膠質(zhì)瘤占膠質(zhì)瘤總數(shù)的13%，主要為星形細胞瘤。
膠質(zhì)細胞瘤,也稱神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤,發(fā)生于神經(jīng)外胚葉組織,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見的原發(fā)性腫瘤。過去認為,膠質(zhì)細胞瘤多見于成年人;目前發(fā)現(xiàn),本病在其他年齡段均有發(fā)病率逐漸增高的趨勢。
二、LN-18人神經(jīng)膠質(zhì)瘤貼壁細胞系培養(yǎng)操作
1）復蘇LN-18人神經(jīng)膠質(zhì)瘤貼壁細胞系細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2）LN-18人神經(jīng)膠質(zhì)瘤貼壁細胞系細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）LN-18人神經(jīng)膠質(zhì)瘤貼壁細胞系細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
下面T25瓶為類；
1.細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細胞，根據(jù)細胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細胞懸液，注意凍存管做好標識。
3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應用
LN-18人神經(jīng)膠質(zhì)瘤貼壁細胞系可以用于STAT3及其相關(guān)因子在白藜蘆醇抗原發(fā)性腦腫瘤作用中的意義分析：
在髓母細胞瘤細胞系UW228-3細胞和膠質(zhì)母細胞瘤細胞系LN-18細胞中研究白藜蘆醇(Resveratrol,Res)對STAT3及其相關(guān)因子LIF、c-Myc、Survivin、Cox-2、CyclinD1、Bcl-2表達情況的影響,以及STAT3和細胞的生長、分化、凋亡與耐藥之間的關(guān)系,探討白藜蘆醇在抗髓母細胞瘤和膠質(zhì)母細胞瘤作用中的分子機制,為改善髓母細胞瘤和膠質(zhì)母細胞瘤的臨床化學治療現(xiàn)狀提供新的實驗室指標和理論根據(jù)。
方法：人髓母細胞瘤細胞系UW228-3細胞和膠質(zhì)母細胞瘤細胞系LN-18細胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培養(yǎng)液中,以5×104/ml的初始細胞密度接種于Φ60mm和Φ100mm的培養(yǎng)皿中,24小時后用100μM白藜蘆醇進行處理。將白藜蘆醇溶解于二甲基亞砜(DMSO,demethylsulfoxide)溶液中,以5mM的濃度儲存,使用前稀釋到100μM。用100μM白藜蘆醇(resveratrol,Res),處理細胞48小時,觀察其對細胞的作用效果。為便于觀察細胞形態(tài)學特征和進行免疫細胞化學(ICC)染色,將無菌蓋玻片預先置于培養(yǎng)皿底部制備細胞爬片,待取出時用100%冷丙酮進行固定。同時收集細胞懸液并離心沉淀以用于RNA和蛋白質(zhì)的提取。
采用免疫細胞化學、RT-PCR和Western-blotting等方法系統(tǒng)檢測髓母細胞瘤細胞系UW228-3細胞和膠質(zhì)母細胞瘤細胞系LN-18細胞中STAT3及其相關(guān)因子LIF、c-Myc、Survivin、Cox-2、CyclinD1和Bcl-2在100μM白藜蘆醇處理前后表達水平的改變、細胞內(nèi)的分布狀況及其與分化和凋亡的關(guān)系。
結(jié)果：
1)用100μM白藜蘆醇處理細胞48h時后,對白藜蘆醇敏感的髓母細胞瘤細胞系UW228-3細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,而白藜蘆醇并不能引起膠質(zhì)母細胞瘤細胞系LN-18細胞形態(tài)的變化。
2)在髓母細胞瘤細胞系UW228-3細胞中,白藜蘆醇可以下調(diào)STAT3的表達水平并且使其核易位程度明顯減少,而在膠質(zhì)母細胞瘤細胞系LN-18細胞中,白藜蘆醇可使STAT3發(fā)生核易位但對STAT3表達水平的影響很小。
3)白藜蘆醇可以明顯上調(diào)髓母細胞瘤細胞系UW228-3細胞中LIF的表達水平,而對膠質(zhì)母細胞瘤細胞系LN-18細胞中LIF表達水平的影響甚小。
4)在髓母細胞瘤細胞系UW228-3細胞中,100μM白藜蘆醇可不同程度地下調(diào)c-Myc、Survivin、Cox-2和CyclinD1的表達水平,上調(diào)Bcl-2的表達水平,而在膠質(zhì)母細胞瘤細胞系LN-18細胞中100μM白藜蘆醇對c-Myc、Survivin、Cox-2、CyclinD1和Bcl-2表達水平皆無明顯影響。
結(jié)論：
1)本研究證實100μtM白藜蘆醇在誘導髓母細胞瘤細胞系UW228-3細胞發(fā)生分化和調(diào)亡的同時,抑制了STAT3通路的活化,而在膠質(zhì)母細胞瘤細胞系LN-18細胞中白藜蘆醇未呈現(xiàn)其抗腫瘤作用但是STAT3發(fā)生核易位。
2)髓母細胞瘤細胞系UW228-3細胞對白藜蘆醇的作用較敏感,而膠質(zhì)母細胞瘤細胞系LN-18細胞對白藜蘆醇的作用則具有耐藥性。
3)本研究進一步證實了對STAT3信號轉(zhuǎn)導通路的抑制是白藜蘆醇抗原發(fā)性腦腫瘤作用的重要分子機制。
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