一、背景
大鼠小腸隱窩上皮細胞是來源于18-24日齡的雄性Charles River Sprague Dawley(CD(SD))大鼠小腸的正常上皮細胞。IEC-6細胞可以合成纖維連接蛋白和膠原，具有體內(nèi)腸上皮細胞特異性的細胞表面抗原，生長受到皮質(zhì)醇的抑制。IEC-6細胞是一種有限細胞系，細胞在老化前保持恒定的生長速度和細胞形態(tài)。
二、大鼠小腸隱窩上皮細胞培養(yǎng)步驟
1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備DMEM培養(yǎng)基(DMEM，GIBCO，貨號11965-092)，90%；北美胎牛血清(United States，GIBCO，貨號16000-044)，10%，添加0.1u/mL胰島素。
2）大鼠小腸隱窩上皮細胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）大鼠小腸隱窩上皮細胞凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。
2、大鼠小腸隱窩上皮細胞處理：
1）復蘇大鼠小腸隱窩上皮細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2）大鼠小腸隱窩上皮細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）大鼠小腸隱窩上皮細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進行凍存。
三、應(yīng)用
大鼠小腸隱窩上皮細胞可以用于補中益氣丸對IEC-6細胞損傷模型NLRP3炎性體及相關(guān)細胞因子的影響：
實驗采取大鼠小腸隱窩上皮細胞(Intestinal epithelial cell,IEC-6)損傷模型,分析補中益氣丸含藥血清干預后NLRP3炎性體及其相關(guān)炎癥因子的變化,進一步探討補中益氣丸的藥物作用機制。
內(nèi)容：1、補中益氣丸含藥血清對IEC-6細胞損傷模型干預后細胞增殖的影響比較TNBS大鼠模型血清與TNF-α刺激對IEC-6細胞后引起的細胞損傷,建立細胞損傷模型,同時觀測補中益氣丸含藥血清對IEC-6損傷模型的影響。
方法：分別用TNF-α和TNBS大鼠模型血清刺激IEC-6后,加補中益氣丸含藥血清干預,采用CCK-8法檢測補中益氣丸含藥血清作用24h后細胞增殖情況。結(jié)果:與胎牛血清組相比,TNF-α對細胞增殖具有明顯抑制作用(P<0.01)。與空白對照組相比較,TNBS大鼠模型血清刺激后對細胞的增殖同樣有抑制作用(P<0.01),與TNF-α刺激后相比較,血清刺激后對細胞增殖的影響相對較小,TNBS大鼠模型血清刺激后,補中益氣丸含藥血清對細胞有明顯的促進作用(P<0.01),細胞增殖能力有所恢復。
2、補中益氣丸含藥血清對IEC-6細胞損傷模型干預后NLRP3、Caspase-1、ASCmRNA表達的影響核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)家族成員NLRP3作為NLRP3炎性體的危險信號感受器,通過內(nèi)源和外源危險因素刺激激活后,與凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)組裝成NLRP3炎性體,激活半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1(Caspase-1),進而促進促炎因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白介素-18(Interleukin-18,IL-18)的剪切,成熟和分泌,同時促進有促炎和抗炎雙重性的細胞因子IL-33的成熟和分泌,通過下游信號轉(zhuǎn)導通路,引發(fā)一系列炎癥和免疫反應(yīng),參與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生與發(fā)展。
通過探討補中益氣丸對損傷后IEC-6細胞NLRP3、Caspase-1、ASCmRNA表達的影響,從而分析補中益氣丸對細胞損傷的修復機制。
方法：用10%模型血清復制細胞損傷模型,10%補中益氣丸含藥血清和10%柳氮磺吡啶對損傷后的細胞干預24h后,采用實時定量熒光PCR方法檢測IEC-6細胞中NLRP3、Caspase-1、ASCmRNA表達,并對其進行統(tǒng)計學分析。
結(jié)果：與空白對照組相比,模型對照組NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA的表達有升高的趨勢;與模型對照組相比,補中益氣丸組NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA的表達有降低的趨勢,柳氮磺吡啶組NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA的表達有降低的趨勢。
3、補中益氣丸含藥血清對損傷后IEC-6細胞NLRP3炎性體相關(guān)蛋白表達的影響觀察補中益氣丸含藥血清對損傷后IEC-6細胞NLRP3炎性體相關(guān)蛋白表達的影響,進而分析補中益氣丸對細胞損傷的修復機制。
方法：用10%模型血清復制細胞損傷模型,10%補中益氣丸含藥血清和10%柳氮磺吡啶對損傷后的細胞干預24h后,采用Western blot方法檢測IEC-6細胞中NLRP3、Caspase-1和ASC蛋白的表達,并進行統(tǒng)計學分析。
結(jié)果：與空白對照組相比,模型對照組的NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白相對表達量增高(P<0.01);與模型對照組相比,BZYQW組的NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白相對表達量降低(P<0.05,P<0.01);SASP組的NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白相對表達量明顯降低(P<0.01)。
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