一、背景
KLE人子宮內(nèi)膜癌貼壁細(xì)胞是源自一名64歲白人女性的子宮內(nèi)膜腫瘤組織，由G·R·Richardson于1984年建系。KLE細(xì)胞染色體為非整倍體，數(shù)目范圍在51-66之間。KLE細(xì)胞裸鼠植瘤后，其腫瘤標(biāo)本在電鏡下顯示，細(xì)胞間見(jiàn)緊密相連，細(xì)胞表面具有微絨毛。KLE細(xì)胞形態(tài)特征與孕激素刺激后的子宮內(nèi)膜相似。
二、KLE人子宮內(nèi)膜癌貼壁細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1、KLE人子宮內(nèi)膜癌貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備DMEM/F-12（推薦Bios-0005）培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗1%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2、KLE人子宮內(nèi)膜癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞處理：
1）凍存KLE人子宮內(nèi)膜癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞的復(fù)蘇：：
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。
2）KLE人子宮內(nèi)膜癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2、加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化。
3、輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說(shuō)明書(shū)要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。
3）KLE人子宮內(nèi)膜癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
下面T25瓶為例；
1、細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過(guò)程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來(lái)決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml.
2、1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，按每1ml凍存液含1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱(chēng)、代數(shù)、日期等信息。
3、將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過(guò)夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。
三、應(yīng)用
KLE人子宮內(nèi)膜癌貼壁細(xì)胞可以用于分子靶向藥物吉非替尼對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的作用：
選用子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa為研究對(duì)象，在體外實(shí)驗(yàn)中研究吉非替尼誘導(dǎo)Ishikawa細(xì)胞凋亡的作用及其下游可能的信號(hào)通路，初步探討其作用機(jī)制，為子宮內(nèi)膜癌的靶向治療提供新的思路。
方法：
1、細(xì)胞培育：人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa，以含有10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，另加濃度為100U/ml的青霉素及鏈霉素的雙抗，培養(yǎng)于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)。以0.25%胰蛋白酶消化傳代。細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2、應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)不同濃度的吉非替尼對(duì)Ishikawa細(xì)胞生長(zhǎng)的影響程度，同時(shí)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率曲線。
3、應(yīng)用流式細(xì)胞儀(flowcytometry,FCM)檢測(cè)不同濃度吉非替尼作用前后對(duì)Ishikawa細(xì)胞周期變化及細(xì)胞凋亡率的影響情況。
4、應(yīng)用Western-Blot方法檢測(cè)不同濃度吉非替尼對(duì)Ishikawa細(xì)胞p-Akt、CyclinD1蛋白水平表達(dá)的影響。
結(jié)果：
1、吉非替尼對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa增殖的影響：不同濃度的吉非替尼(5uM,10uM,20uM,40uM)作用Ishikawa細(xì)胞24小時(shí)后抑制率分別為5.11±0.44%、10.58±0.07%、18.19±0.63%、33.03±0.46%；作用48小時(shí)后抑制率分別為7.52±0.71%、16.52±0.25%、30.42±0.55%、45.09±0.47%；作用72小時(shí)后抑制率分別為15.38±0.59%、27.78±0.22%、42.61±0.40%、57.03±0.44%。數(shù)據(jù)表明吉非替尼明顯抑制Ishikawa細(xì)胞的增殖，分別隨著吉非替尼濃度的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率逐漸增加，呈時(shí)間-劑量依賴(lài)關(guān)系(P<0.05)。
2、吉非替尼對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa形態(tài)的影響：對(duì)照組的Ishikawa細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈細(xì)長(zhǎng)多邊形，排列緊密，貼壁良好，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。不同濃度(5uM,10uM,20uM,40uM)的吉非替尼作用Ishikawa細(xì)胞48h后，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮變形，形態(tài)輪廓不清晰，細(xì)胞貼壁能力下降，脫壁懸浮。部分細(xì)胞崩解壞死。部分細(xì)胞出胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡，呈現(xiàn)出細(xì)胞核濃縮、核碎裂等凋亡特征。貼壁細(xì)胞的密度明顯少于對(duì)照組，凋亡細(xì)胞的數(shù)目多于對(duì)照組。
3、吉非替尼對(duì)Ishikawa細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響：不同濃度(5uM,10uM,20uM,40uM)的吉非替尼作用于Ishikawa細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞凋亡情況如下：對(duì)照組為0.45±0.18%，實(shí)驗(yàn)組分別為2.47±0.64%、7.42±1.38%、14.05±3.00%、18.20±1.82%。隨著吉非替尼濃度的增加，Ishikawa細(xì)胞的凋亡率逐漸增加，不同濃度組間差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度的吉非替尼作用于Ishikawa細(xì)胞48小時(shí)后，G0/G+1期細(xì)胞比例隨著藥物濃度的增大而升高，與對(duì)照組相比，不同濃度組間差異明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明細(xì)胞周期停滯于G0/G1期。而對(duì)S期，G2//M期細(xì)胞比例無(wú)明顯影響，與對(duì)照組相比，不同濃度組間差異不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
4、吉非替尼引起細(xì)胞周期阻滯的內(nèi)在機(jī)制：應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)不同濃度吉非替尼作用Ishikawa細(xì)胞48h后p-Akt、CyclinD1蛋白水平變化，結(jié)果顯示：p-Akt、CyclinD1蛋白在Ishikawa細(xì)胞中均有表達(dá)。經(jīng)過(guò)不同濃度(5uM,10uM,20uM,40uM)的吉非替尼作用后，Ishikawa細(xì)胞中p-Akt、CyclinD1蛋白濃度隨著吉非替尼濃度的增加而逐漸下降，并呈劑量依賴(lài)性，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
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