一、背景
人卵巢癌細(xì)胞是從一名47歲的黑人婦女的外科腫瘤標(biāo)本中建立的。該腫瘤被描述為低分化卵巢透明細(xì)胞癌。最初，細(xì)胞生長在軟瓊脂中。在裸鼠中成瘤。該細(xì)胞對多種化療藥物包括doxorubicin,cisplatin,carmustine,etoposide和cyanomorpholinodoxorubicin(MRA-CN)表現(xiàn)出低到中等的耐受性。ES-2細(xì)胞表達(dá)低水平的P糖蛋白。
二、人卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1）復(fù)蘇人卵巢癌細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL人卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）人卵巢癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對于人卵巢癌細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的*培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打人卵巢癌細(xì)胞，脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
3）人卵巢癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，進(jìn)行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入血清及DMSO，凍存比例為90%FBS+10%DMSO。
三、應(yīng)用
人卵巢癌細(xì)胞可以用于E3泛素連接酶UBR5在卵巢癌細(xì)胞ES-2中的功能初探；
卵巢透明細(xì)胞癌是上皮性卵巢癌的一種,屬于惡性腫瘤,早期所占比例較大,5年的生存率較高,但是一旦發(fā)展到晚期,相比于卵巢癌其他類型生存率更低。臨床上的治療方案基本是參考卵巢漿液性癌。
了解卵巢癌發(fā)病機(jī)制,能夠更好地預(yù)測和篩查風(fēng)險人群,同時識別潛在的病因有助于降低卵巢癌發(fā)病率。UBR5(Ubiquitin protein ligase E3component n-recognin 5,UBR5)是一種E3泛素連接酶,最初作為腫瘤抑制因子在乳腺癌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn),參與泛素化過程及DNA損傷、細(xì)胞增殖、細(xì)胞代謝、細(xì)胞遷移侵襲與凋亡等多種重要的生物學(xué)過程。
有研究顯示,UBR5在卵巢癌中高表達(dá),有研究人員建議將其作為卵巢癌患者預(yù)后不良的指標(biāo),但UBR5在卵巢癌中的功能與作用機(jī)制尚不清楚。
因此,本研究通過細(xì)胞生物學(xué)、生物信息學(xué)等方法探究UBR5在卵巢癌細(xì)胞系ES-2中的功能及可能的作用機(jī)制。對Ualcan數(shù)據(jù)庫中不同癌癥中UBR5表達(dá)情況分析結(jié)果顯示,UBR5在肺腺癌、膽管癌、食道癌、胃癌、結(jié)腸腺癌、直腸癌等患者的癌癥組織中均高表達(dá)。
對來自Expression Atlas數(shù)據(jù)庫以及癌細(xì)胞系百科全書(Cancer Cell Line Encyclopedia,CCLE)中的7種人類卵巢癌細(xì)胞系的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)UBR5在卵巢癌細(xì)胞系ES-2中高表達(dá)。
本實驗通過Western blot和RT-q PCR發(fā)現(xiàn)與正常上皮細(xì)胞IOSE80相比,UBR5在ES-2細(xì)胞中高表達(dá),因此,我們選擇卵巢癌細(xì)胞ES-2作為實驗材料,利用CRISPR-Cas9與sh RNA技術(shù)對UBR5進(jìn)行敲除與敲低,以探究UBR5在卵巢癌細(xì)胞ES-2中的功能及可能機(jī)制。
結(jié)果顯示,敲除與敲低UBR5后,ES-2細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力、遷移與侵襲能力減弱,細(xì)胞周期阻滯于S和G2/M期,細(xì)胞凋亡增加。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示,敲低UBR5后有7697個基因的表達(dá)水平發(fā)生顯著變化,這些差異表達(dá)基因主要富集于細(xì)胞生長、細(xì)胞黏附等生物過程,細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞骨架等細(xì)胞組分及細(xì)胞表面受體信號通路、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)等生物功能。這些結(jié)果顯示,UBR5與ES-2細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、細(xì)胞周期調(diào)控以及凋亡有關(guān)。
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