一、背景
SK-HEP-1細(xì)胞已被鑒定為內(nèi)皮來源。SK-HEP-1細(xì)胞為異倍體女性人(XX)，染色體在亞三倍體范圍內(nèi)。在裸鼠中，SK-HEP-1細(xì)胞能形成與肝癌相一致的大細(xì)胞癌。
二、SK-HEP-1細(xì)胞培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇SK-HEP-1細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6 cm皿中，加入約4 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)SK-HEP-1細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2 min（視細(xì)胞情況而定），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2-3ml完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
c、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)SK-HEP-1細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
SK-HEP-1可以用于松花粉誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株SK-Hep-1細(xì)胞增殖、凋亡和自噬及其機(jī)制研究：
通過觀察松花粉對人肝癌細(xì)胞株SK-Hep-1細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期和自噬的影響,進(jìn)一步探討松花粉抗肝癌作用及其機(jī)制,為松花粉的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法：體外培養(yǎng)人肝癌SK-Hep-1細(xì)胞,隨機(jī)分為4組,分別為對照組(0 mg/m L松花粉)、實(shí)驗(yàn)組(30、45、60 mg/m L松花粉)。
(1)采用細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒CCK-8,檢測不同濃度松花粉干預(yù)不同時間(12、24、48和72 h)后的SK-Hep-1細(xì)胞抑制率;
(2)松花粉作用2 w后,平板克隆實(shí)驗(yàn)觀察松花粉對SK-Hep-1細(xì)胞克隆、增殖的影響;
(3)松花粉處理48 h后,倒置相差顯微鏡觀察松花粉干預(yù)后的SK-Hep-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;
(4)Hoechst 33258熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化和Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡的情況;
(5)流式細(xì)胞儀檢測SK-Hep-1細(xì)胞的細(xì)胞周期變化;
(6)RT-PCR方法檢測自噬相關(guān)基因Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62 m RNA的表達(dá)水平,Western blot法檢測自噬相關(guān)基因Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62的蛋白表達(dá)水平;
(7)數(shù)據(jù)處理采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間比較采用one-way ANOVA或非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行比較,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果：
(1)CCK-8法檢測顯示,松花粉能明顯抑制SK-Hep-1細(xì)胞增殖,并具有時間和劑量依賴性;
(2)平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示,隨著松花粉濃度的增高,細(xì)胞形成集落數(shù)量減少;
(3)倒置相差顯微鏡顯示,松花粉可以抑制細(xì)胞的增殖;
(4)Hoechst 33258熒光染色顯示,松花粉可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡;Annexin V-FITC/PI雙染法顯示,與對照組比較,松花粉不同濃度組干預(yù)后細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05或P<0.01),并且細(xì)胞凋亡率隨著藥物作用濃度的增高而增加;
(5)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)顯示,松花粉能使SK-Hep-1細(xì)胞周期阻滯于G1期,同時S期和G2期的細(xì)胞比例也下降;
(6)RT-PCR分析顯示,經(jīng)松花粉(30、45、60 mg/m L)處理后,Beclin-1、LC3-Ⅱ的m RNA表達(dá)較對照組明顯增加(P<0.05或P<0.01),而P62的m RNA表達(dá)較對照組降低(P<0.05或P<0.01);Western blot法檢測自噬相關(guān)基因蛋白的表達(dá)水平,也同樣得出相同的結(jié)論。這進(jìn)一步證明了松花粉對人肝癌SK-Hep-1細(xì)胞具有促進(jìn)自噬的作用。
結(jié)論：
(1)松花粉能明顯降低人肝癌SK-Hep-1細(xì)胞增殖能力,且呈劑量和時間依賴性;松花粉能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡并使細(xì)胞阻滯于細(xì)胞周期G1期。
(2)松花粉可使人肝癌SK-Hep-1細(xì)胞中自噬增強(qiáng),促進(jìn)人肝癌細(xì)胞株SK-Hep-1細(xì)胞的自噬作用,其機(jī)制可能是通過提高人肝癌SK-Hep-1細(xì)胞Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá),降低SK-Hep-1細(xì)胞P62表達(dá),通過誘導(dǎo)自噬從而發(fā)揮抗肝癌的作用。
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