一、背景
CAL27細(xì)胞系人舌鱗狀癌細(xì)胞該細(xì)胞1982年由J.Gioanni建系，源自一位56歲白人男性的舌頭中倍的病變部位，角蛋白強(qiáng)陽(yáng)性。
二、CAL27細(xì)胞系人舌鱗狀癌細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1）復(fù)蘇CAL27細(xì)胞系人舌鱗狀癌細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mLCAL27細(xì)胞系人舌鱗狀癌細(xì)胞培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有CAL27細(xì)胞系人舌鱗狀癌細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）CAL27細(xì)胞系人舌鱗狀癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁CAL27細(xì)胞系人舌鱗狀癌細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2、加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的CAL27細(xì)胞系人舌鱗狀癌細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化。
3、輕輕吹打CAL27細(xì)胞系人舌鱗狀癌細(xì)胞，CAL27細(xì)胞系人舌鱗狀癌細(xì)胞脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4、按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將CAL27細(xì)胞系人舌鱗狀癌細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
3）CAL27細(xì)胞系人舌鱗狀癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，CAL27細(xì)胞系人舌鱗狀癌細(xì)胞變圓脫落后，進(jìn)行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入血清及DMSO，凍存比例為90%FBS+10%DMSO。
三、應(yīng)用
CAL27細(xì)胞系人舌鱗狀癌細(xì)胞可以用于YAP基因?qū)谇击[癌細(xì)胞系CAL27增殖凋亡的影響及機(jī)制研究：
探討YAP對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞CAL27的增殖和凋亡的影響,并研究其在體內(nèi)體外促腫瘤的作用和機(jī)制,為YAP基因作為口腔鱗癌治療新的靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
實(shí)驗(yàn)方法：
1、用免疫組化法檢測(cè)不同分化程度的口腔鱗癌和正?？谇簧掀そM織中YAP蛋白的表達(dá)情況。
2、檢測(cè)YAP在4株口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平,并選擇CAL27作為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)材料。利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染CAL27細(xì)胞,分別構(gòu)建敲除和過(guò)表達(dá)YAP基因及對(duì)照組的口腔鱗癌細(xì)胞系。通過(guò)QRT-PCR及Western blot檢測(cè)敲除和過(guò)表達(dá)效率。
3、利用CCK-8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn),EdU染色法,克隆形成實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)敲除和過(guò)表達(dá)YAP對(duì)CAL27細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)YAP對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。通過(guò)QRT-PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)C-MYC、BCL-2等周期和凋亡相關(guān)因子隨YAP表達(dá)改變時(shí)的情況。
4、以不同濃度的Hippo-YAP信號(hào)通路抑制劑維替泊芬處理CAL27細(xì)胞,利用CCK-8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡和周期的改變;利用QRT-PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)C-MYC和BCL-2等因子隨抑制劑濃度改變情況。
5、利用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn),將敲除組、過(guò)表達(dá)組及相應(yīng)對(duì)照組CAL27細(xì)胞注入到裸鼠皮下,觀察腫瘤生長(zhǎng)情況,分析YAP的不同表達(dá)水平對(duì)口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展的影響。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1、YAP蛋白在正常口腔上皮組織中基本不表達(dá),或表達(dá)較弱;口腔鱗狀細(xì)胞癌中,YAP蛋白的表達(dá)水平較高,與腫瘤分化程度有關(guān)。
2、在CAL27細(xì)胞中,YAP基因和蛋白表達(dá)水平適中。在敲除YAP基因后,YAP及其下游靶基因CTGF、ANKRD、CYR61表達(dá)水平明顯降低,同時(shí)細(xì)胞中總YAP和細(xì)胞核中YAP表達(dá)水平均降低。過(guò)表達(dá)YAP基因后,YAP及其下游靶基因CTGF、ANKRD、CYR61表達(dá)水平明顯升高,而細(xì)胞中總YAP和胞核中YAP表達(dá)水平均升高。
3、與對(duì)照組相比,敲除YAP基因后,CAL27細(xì)胞增殖較慢,細(xì)胞周期阻滯,同時(shí)早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞比例均升高;C-MYC和BCL-2mRNA及蛋白表達(dá)水平均降低;周期相關(guān)蛋白CyclinD1表達(dá)水平下降,促凋亡蛋白BAX、Caspase7表達(dá)水平升高。過(guò)表達(dá)YAP基因后,CAL27細(xì)胞增殖加快,細(xì)胞周期進(jìn)展加速,早、晚期凋亡細(xì)胞比例均降低;C-MYC和BCL-2表達(dá)水平升高;CyclinD1蛋白表達(dá)水平升高,BAX、Caspase7蛋白表達(dá)水平下降。
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