一、背景
HUCC-T1人膽管癌貼壁細(xì)胞系是從一名56歲患者腹水惡性細(xì)胞中分離得到的。原發(fā)性肝腫瘤的組織學(xué)表現(xiàn)為中分化的腺癌。用含0.2%乳白蛋白水解物的RPMI 1640培養(yǎng)基對(duì)腹水腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)細(xì)胞在第25代呈指數(shù)增長(zhǎng)，呈單層生長(zhǎng)，增殖時(shí)間為74 h。呈上皮樣形態(tài)，粘液染色陽(yáng)性。超微結(jié)構(gòu)研究顯示細(xì)胞表面存在微絨毛，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器發(fā)育不良。裸鼠中具有致瘤性。hucc-t1染色體數(shù)目在61~80條之間。
這些人膽管細(xì)胞癌細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中分泌多種腫瘤標(biāo)志物，包括碳水化合物抗原19/9、碳水化合物抗原125、癌胚抗原和組織多肽抗原。在含1%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hucc-t1細(xì)胞碳水化合物抗原19/9分泌水平是含0.2%乳鈣蛋白水解物的6倍。這些結(jié)果提示hucc-t1將為闡明人膽管細(xì)胞癌腫瘤標(biāo)志物分泌和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制提供有用的信息。
二、HUCC-T1人膽管癌貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇HUCC-T1人膽管癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)HUCC-T1人膽管癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)HUCC-T1人膽管癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
HUCC-T1人膽管癌貼壁細(xì)胞系可以用于NK4通過(guò)HIF-1α/VEGF途徑對(duì)膽管癌微血管生成和侵襲的影響：
研究分別從體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型兩個(gè)方面,探討NK4基因?qū)IF-1α/VEGF通路介導(dǎo)的CCA微血管生成和侵襲的影響。
方法：
1、NK4(Hu-NK4)和對(duì)照質(zhì)粒(Hu-Em)穩(wěn)轉(zhuǎn)的人膽管癌HuCC-T1細(xì)胞株在常氧或缺氧條件下用HGF處理,分別通過(guò)MTT、Transwell侵襲試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分析CCA細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡;
2、用HuCC-T1/Em和HuCC-T1/NK4穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株建立裸鼠CCA皮下移植瘤模型,通過(guò)測(cè)量瘤體的大小和重量分析異種移植小鼠模型中人CCA的腫瘤生長(zhǎng),通過(guò)免疫組化測(cè)定CD31陽(yáng)性微血管分析腫瘤血管的生成,通過(guò)Real-time-PCR和Western-blotting分析缺氧誘導(dǎo)因子1-α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和CD31的表達(dá)。
結(jié)果：
1、在常氧和缺氧條件下,過(guò)表達(dá)NK4顯著抑制HuCC-T1細(xì)胞的增殖;并且,在缺氧條件下,NK4對(duì)HuCC-T1細(xì)胞增殖的抑制作用顯著增強(qiáng);
2、在常氧和缺氧條件下,過(guò)表達(dá)NK4顯著促進(jìn)HuCC-T1細(xì)胞凋亡;并且,在缺氧條件下,NK4誘導(dǎo)的HuCC-T1細(xì)胞凋亡顯著增強(qiáng);
3、過(guò)表達(dá)NK4使HuCC-T1細(xì)胞侵襲力減弱,并可抑制缺氧的促侵襲作用;
4、缺氧可上調(diào)HuCC-T1細(xì)胞中的HIF-1α,CD31和VEGF基因的表達(dá),過(guò)表達(dá)NK4下調(diào)HIF-1α、CD31和VEGF表達(dá),抑制缺氧的促微血管生成作用;
5、在HuCC-T1細(xì)胞移植小鼠模型中,過(guò)表達(dá)NK4抑制瘤體生長(zhǎng);
6、過(guò)表達(dá)NK4下調(diào)CCA腫瘤組織中HIF-1α、CD31和VEGF基因的表達(dá),抑制腫瘤微血管的生成。
結(jié)論：
1、HGF拮抗劑NK4在體外顯著抑制膽管癌HuCC-T1細(xì)胞的增殖和侵襲,并誘導(dǎo)HuCC-T1細(xì)胞凋亡;
2、NK4抑制HuCC-T1細(xì)胞HIF-1α、VEGF和CD31等因子的表達(dá),并顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的促腫瘤微血管的生成;
3、在膽管癌小鼠模型中,NK4通過(guò)抑制腫瘤組織HIF-1α、VEGF和CD31等因子的表達(dá),顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)和微血管形成。
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