一、背景
人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細(xì)胞，MSCs可以在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞。
二、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸鈉0.11g/L)；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。
2）人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。
2、細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3、按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4、將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。
三、應(yīng)用
人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以用于miR-155-5p調(diào)控Sort1參與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化：
成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human Mesenchymal Stem Cells,hMSCs)定向分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的比例失衡(成骨細(xì)胞減少、脂肪細(xì)胞增多),將導(dǎo)致骨量下降,是骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此,hMSCs的成脂分化調(diào)控機(jī)制是骨質(zhì)疏松研究的重要基礎(chǔ)理論問(wèn)題之一。Micro RNAs是近年來(lái)證實(shí)的影響成脂分化的重要調(diào)節(jié)因子,其中miR-155在hMSCs定向分化中發(fā)揮調(diào)控作用,但其在成脂分化機(jī)制尚不清楚,明確miR-155-5p調(diào)控Sort1參與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化機(jī)制,為骨質(zhì)疏松癥、肥胖等臨床相關(guān)疾病的防治提供理論依據(jù)。
方法：
1、hMSCs細(xì)胞周期和表面標(biāo)記的檢測(cè)hMSCs純化傳代培養(yǎng),流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期,同時(shí)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hMSCs表面標(biāo)記:CD14、CD34、CD45、HLA-DR;CD29、CD44、CD90、CD105;Moμse Ig2a、Moμse Ig1陰性對(duì)照。
2、正常成脂誘導(dǎo),hMSCs成脂效率評(píng)價(jià)第六代hMSCs細(xì)胞給予成脂分化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)7天,14天,油紅O染色后觀察脂滴形成情況;qRT-PCR分析Ap2、PPARγ、CEBPα等成脂標(biāo)志性基因的表達(dá),Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。
3、miR-155-5p的表達(dá)檢測(cè)miR-155-5p在hMSCs細(xì)胞給予成脂分化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)7天、14天脂肪形成過(guò)程中,采用qRT-PCR分析miR-155-5p的表達(dá)。
4、過(guò)表達(dá)miR-155-5p后,hMSCs成脂效率評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)miR-155-5p慢病毒后,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后,進(jìn)行細(xì)胞成脂誘導(dǎo),在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)收集細(xì)胞,油紅O進(jìn)行染色,觀察結(jié)果,異丙醇洗脫后,酶標(biāo)儀490nm測(cè)量OD值,以定量細(xì)胞內(nèi)脂滴積累情況;采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)基因表達(dá)情況,Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。
5、miR-155-5p及其靶基因的篩選和驗(yàn)證針對(duì)hMSCs成脂分化過(guò)程,運(yùn)用Illumina Hi Seq X ten平臺(tái)實(shí)施Small RNA動(dòng)態(tài)測(cè)序,關(guān)聯(lián)m RNA-seq(轉(zhuǎn)錄組測(cè)序)結(jié)果,聯(lián)合分析miRNA及m RNA的表達(dá)趨勢(shì),聚類分析差異表達(dá)miRNA與m RNA,再結(jié)合靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)(Target Scan、miRanda和Pic Tar)預(yù)測(cè)miRNA潛在靶基因,聚焦miR-155-5p及潛在靶基因Sort1。qRT-PCR、Western blot檢測(cè)Sort1在hMSCs成脂分化過(guò)程中基因表達(dá)及蛋白水平;采用雙熒光素酶技術(shù)驗(yàn)證miR-155-5p靶向作用Sort1基因。
6、Sort1基因表達(dá)和蛋白水平檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-155-5p后,細(xì)胞給予成脂分化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)7天,14天,qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)靶基因Sort1的表達(dá)水平,Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)。
結(jié)果：
1、檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞周期:S+G2/M期細(xì)胞15%,G0/G1期的細(xì)胞85%。hMSCs表面標(biāo)記:CD14、CD34、CD45、HLA-DR(陰性結(jié)果);CD29、CD44、CD90、CD105(陽(yáng)性結(jié)果);Moμse Ig2a、Moμse Ig1陰性對(duì)照。hMSCs同時(shí)滿足細(xì)胞周期和表面標(biāo)記的要求。
2、正常成脂誘導(dǎo),油紅O染色結(jié)果顯示脂滴明顯增多,qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示成脂標(biāo)志基因表達(dá)明顯逐漸升高,成脂效率高。
3、hMSCs成脂分化過(guò)程中,qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示miR-155-5p表達(dá)呈明顯逐漸下降趨勢(shì)。
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