一、背景
人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞分離自直腸原位癌。人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞系在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下匯合后，自發(fā)分化為腸上皮樣細(xì)胞，是常用的腸癌細(xì)胞模型。當(dāng)長(zhǎng)到滿時(shí)，細(xì)胞表現(xiàn)出特征性的腸上皮細(xì)胞分化。Caco-2細(xì)胞表達(dá)維甲酸結(jié)合蛋白I和維甲酸結(jié)合蛋白II，并呈角質(zhì)蛋白陽(yáng)性。
二、人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)
1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基78%
優(yōu)質(zhì)胎牛血清20%
P/S青霉素-鏈霉素1%
MEMNEAA非必需氨基酸1%
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
1）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2、細(xì)胞處理：
1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2、加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化。
3、輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說(shuō)明書(shū)要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。
3）細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
三、應(yīng)用
人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞可以用于大黃附子有效成分配伍在Caco-2細(xì)胞模型上的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究：
研究大黃酸、大黃素、去甲烏藥堿、苯甲酰烏頭原堿,以及大黃酸、大黃素分別與去甲烏藥堿、苯甲酰烏頭原堿、烏頭堿配伍后在人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞(Caco-2)細(xì)胞模型上轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程,并探討其配伍機(jī)制。
方法：以大黃酸、大黃素、苯甲酰烏頭原堿、去甲烏藥堿在Caco-2細(xì)胞上的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量還有表觀滲透系數(shù)Papp值為指標(biāo),采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)大黃酸、大黃素、去甲烏藥堿、苯甲酰烏頭原堿的含量進(jìn)行檢測(cè),考察大黃酸、大黃素、去甲烏藥堿、苯甲酰烏頭原堿在Caco-2細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn)行為,以及大黃素、大黃酸、與去甲烏藥堿、苯甲酰烏頭原堿、烏頭堿分別配伍后轉(zhuǎn)運(yùn)行為的變化。
通過(guò)免疫熒光PCR方法檢測(cè)大黃素、大黃酸與去甲烏藥堿、苯甲酰烏頭原堿、烏頭堿配伍后對(duì)Caco-2細(xì)胞中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白:乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)、P-糖蛋白(Pgp)、多耐藥相關(guān)蛋白(MRP2、MRP3)基因表達(dá)的影響。通過(guò)western-blot方法檢測(cè)大黃素、大黃酸與去甲烏藥堿、苯甲酰烏頭原堿、烏頭堿配伍后對(duì)Caco-2細(xì)胞中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)、P-糖蛋白(P-gp)、多耐藥相關(guān)蛋白(MRP2、MRP3)蛋白表達(dá)的影響。
結(jié)果：去甲烏藥堿Papp值均在1×10-7cm·s-1數(shù)量級(jí),外排與吸收比值約為1.5,配伍大黃酸、大黃素后其Papp值均顯著性上升(P<0.05)。苯甲酰烏頭原堿配伍大黃酸后Papp值顯著性上升(P<0.05),苯甲酰烏頭原堿配伍大黃素后Papp值顯著性下降(P<0.05)。
大黃素配伍苯甲酰烏頭原堿后Papp值顯著性上升(P<0.05)。大黃素配伍去甲烏藥堿、烏頭堿后Papp值顯著性下降(P<0.05)。大黃酸配伍去甲烏藥堿、苯甲酰烏頭原堿、烏頭堿后Papp值顯著性下降(P<0.05)。去甲烏藥堿促進(jìn)外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BCRP、MRP2的表達(dá),抑制P-gp的表達(dá)。
配伍大黃酸后抑制P-gp的表達(dá);配伍大黃素后抑制Caco-2中MRP2和BCRP的表達(dá)。苯甲酰烏頭原堿可以促進(jìn)BCRP、MRP2的表達(dá),抑制MRP3的表達(dá);配伍大黃酸后,下調(diào)MRP2、BCRP的表達(dá)。大黃酸可以抑制BCRP的表達(dá)量;配伍去甲烏藥堿后,MRP2的蛋白表達(dá)量上調(diào);大黃酸配伍苯甲酰烏頭原堿后,促進(jìn)BCRP的表達(dá),下調(diào)MRP3的表達(dá)。
大黃酸配伍烏頭堿后,誘導(dǎo)MRP2、BCRP的表達(dá)。大黃素誘導(dǎo)了MRP3和BCRP的表達(dá)。配伍去甲烏藥堿后,促進(jìn)MRP2的表達(dá)。配伍苯甲酰烏頭原堿后P-gp外排。配伍烏頭堿后,誘導(dǎo)了MRP2的外排作用。
結(jié)論：大黃通過(guò)增加附子中水溶性成分和單酯型生物堿的吸收來(lái)增加附子的治療作用,而附子通過(guò)降低大黃蒽醌的吸收來(lái)降低大黃的寒性物質(zhì)基礎(chǔ),減輕大黃對(duì)人體的副作用。其作用機(jī)理與各個(gè)成分對(duì)外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp、MRP2、MRP3或BCRP的抑制或誘導(dǎo)作用有關(guān)。
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