一、背景
THLE-2人肝永生化貼壁細(xì)胞系是正常肝細(xì)胞用SV40大T抗原轉(zhuǎn)染得到。將含有SV40 T抗原的Bgl I-Hpa I片段的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入兼嗜性包裝細(xì)胞株P(guān)A317中生產(chǎn)病毒。THLE-2 and THLE-3表達(dá)正常成人肝上皮細(xì)胞特征性的表型。當(dāng)注射到無(wú)胸腺裸鼠中時(shí)，它們不成瘤，具有接近二倍體的核型，不表達(dá)甲胎蛋白。
二、THLE-2細(xì)胞人肝永生化細(xì)胞培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇THLE-2人肝永生化貼壁細(xì)胞系細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）THLE-2人肝永生化貼壁細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）THLE-2人肝永生化貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為類；
1.細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
THLE-2人肝永生化貼壁細(xì)胞系可以用于三氯乙烯誘導(dǎo)人肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的效應(yīng)及機(jī)制研究：
三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)是一種生產(chǎn)環(huán)境中常見(jiàn)的有機(jī)污染物,屬于人類Ⅰ類致癌物。
以人永生化肝細(xì)胞為模型,研究TCE誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化效應(yīng)及其潛在機(jī)制,并根據(jù)篩選的靶分子設(shè)計(jì)合成新型姜黃素衍生物B5,進(jìn)一步探討B(tài)5對(duì)惡性轉(zhuǎn)化的逆轉(zhuǎn)效果,有望為TCE職業(yè)暴露預(yù)防與控制提供理論基礎(chǔ)。
研究方法人永生化THLE-2暴露于5 mMTCE培養(yǎng)30代,獲得THLE-2-TCE細(xì)胞。細(xì)胞水平研究細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、增殖遷移能力和基因組差異;動(dòng)物水平觀察THLE-2-TCE異種移植于BALB/c裸鼠后的成瘤潛力、新生物組織病理學(xué)和分子生物學(xué)(cytokeratin和Ki-67)。
隨后通過(guò)氧化應(yīng)激抑制劑N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)來(lái)探討氧化應(yīng)激的生成及其對(duì)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程的調(diào)控作用;在此基礎(chǔ)上,結(jié)合Label free定量結(jié)果,采用通路蛋白抑制劑和si-RNA慢病毒干擾等技術(shù)探究TCE誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的可能分子機(jī)制。最后,根據(jù)篩選的分子機(jī)制靶點(diǎn)(AKT、NFκB),利用孿藥設(shè)計(jì)的化學(xué)方法合成新型姜黃素衍生物B5,通過(guò)分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬,綜合評(píng)估B5逆轉(zhuǎn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的效應(yīng)并再次驗(yàn)證所篩選的靶分子機(jī)制。
研究結(jié)果(1)THLE-2-TCE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)生物學(xué)表征:
(1)形態(tài)學(xué)表征:THLE-2-TCE細(xì)胞部分重疊生長(zhǎng),細(xì)胞大小不一,呈長(zhǎng)梭形且有長(zhǎng)長(zhǎng)的突起,可見(jiàn)多核巨細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)異化明顯。
(2)生物功能表征:THLE-2-TCE細(xì)胞倍增時(shí)間(49.92±0.49 h)較對(duì)照組(75.06±1.71 h)明顯縮短;克隆增殖能力增強(qiáng);細(xì)胞24 h平均遷移率(76.67%)、穿膜細(xì)胞數(shù)目(525.00±13.04個(gè))明顯高于對(duì)照組(20.83%和114.00±6.78個(gè)),以上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
(3)生物表型改變:Label free蛋白定量結(jié)果顯示THLE-2-TCE細(xì)胞基因組不穩(wěn)定。細(xì)胞增殖分化、遷移侵襲和抗凋亡正相關(guān)蛋白(IGF2R、EIF4EBP1、FAM195B、ZNF185、BCAT1等)表達(dá)顯著升高;原癌基因(AKAP8、BCL2L1、AXL、JUND、AKT2等)高表達(dá),而抑癌基因(BCAR1、SAMD9、BCAR3、NFXL1、UIMC1等)表達(dá)顯著降低。差異蛋白功能主要富集在物質(zhì)間(如蛋白質(zhì)、核酸、生物酶和雜環(huán)化合物等)的結(jié)合反應(yīng);氧化磷酸化、細(xì)胞存活和細(xì)胞周期等信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的共性通路,如TGFβ1/SMAD、MAPK、PI3K/AKT/m TOR和NFκB等通路異?；罨?。綜合以上分析結(jié)果,表明THLE-2-TCE細(xì)胞具有惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)生物學(xué)活性。
(4)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn):傳代對(duì)照THLE-2細(xì)胞沒(méi)有形成新生物,THLE-2-TCE細(xì)胞新生物形成率為40.00%,終點(diǎn)體積為406.17±76.98 mm3,HE染色顯示細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,核深染,且異型較明顯,但不及Hep G2陽(yáng)性對(duì)照組顯著。cytokeratin染色陽(yáng)性,系上皮細(xì)胞來(lái)源。Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比例較高,細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。THLE-2-TCE細(xì)胞裸鼠荷瘤模型的建立,表明該細(xì)胞具有一定的體內(nèi)成瘤潛能。
(2)THLE-2-TCE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化潛在分子機(jī)制:
(1)TCE染毒過(guò)程中,THLE-2細(xì)胞內(nèi)ROS、gp91 phox mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均升高。MDA、SOD水平增加。KEAP1表達(dá)持續(xù)降低,而Nrf2和HO-1表達(dá)上調(diào),表明抗氧化系統(tǒng)被激活。NAC預(yù)處理的細(xì)胞遷移率(32.33±6.13%)、侵襲數(shù)(352.00±41.41個(gè))和克隆形成率(230.67±12.04%),分別低于TCE誘導(dǎo)組(47.67±6.13%)、(644.00±39.23個(gè))和(484.00±16.57%)。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中,NAC預(yù)處理組成瘤率為20.00%,低于TCE誘導(dǎo)組(40.00%),且新生物生長(zhǎng)速率、終點(diǎn)體積(173.54±26.39 mm3)和Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)都不及TCE誘導(dǎo)組。
(2)蛋白質(zhì)定量和KEGG分析發(fā)現(xiàn)THLE-2-TCE細(xì)胞TGFβ、AKT、NFκB等分子顯著上調(diào)。NFκB si RNA細(xì)胞克隆形成、侵襲和遷移能力降低,增殖蛋白cyclin D1表達(dá)增加。此外,AKT抑制劑MK-2206和TGFβR抑制劑LY364947處理后,THLE-2-TCE細(xì)胞內(nèi)AKT和NFκB的表達(dá)明顯下調(diào)。TGFβ1刺激后THLE-2細(xì)胞內(nèi)AKT和NFκB表達(dá)呈濃度依賴性上調(diào)。NAC預(yù)處理抑制TGFβ/AKT/NFκB通路活化。
以上結(jié)果表明ROS可能通過(guò)調(diào)控TGFβ/AKT/NFκB信號(hào)軸參與TCE誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化。
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