一、背景
人肺腺癌細(xì)胞源自一位男性肺腺癌患者。人肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1細(xì)胞是一株常用的肺癌細(xì)胞系，也被用于肺癌發(fā)病機(jī)理和抗腫瘤藥物的體外研究試驗(yàn)研究；人肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1細(xì)胞具有典型的上皮細(xì)胞狀形態(tài)結(jié)構(gòu)。
二、人肺腺癌細(xì)胞培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇人肺腺癌細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）人肺腺癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）人肺腺癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為類；
1、細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2、4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
人肺腺癌細(xì)胞可以用于蛇葡萄素鈉體內(nèi)、外協(xié)同卡鉑抗SPC-A-1人肺腺癌細(xì)胞的作用及其機(jī)理研究：
研究蛇葡萄素鈉(AMP-Na)單用及與卡鉑(CBP)合用在體內(nèi)、外對(duì)SPC-A-1人肺腺癌細(xì)胞的抗腫瘤作用及作用機(jī)制。
方法：建立人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型,評(píng)價(jià)AMP-Na單用及與CBP合用對(duì)荷瘤裸鼠在體的抑瘤作用;采用MTT比色法測(cè)定AMP-Na單用及與CBP合用對(duì)SPC-A-1細(xì)胞的體外細(xì)胞毒活性;用流式細(xì)胞儀分析AMP-Na單用及與卡鉑聯(lián)用后對(duì)SPC-A-1細(xì)胞調(diào)亡、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3表達(dá)的影響。
結(jié)果：
1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,AMP-Na 125～260mg/kg各劑量單用對(duì)人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。與CBP合用,可顯著增加CBP對(duì)SPC-A-1細(xì)胞裸鼠移植瘤的抗腫瘤活性,具有協(xié)同抑制作用,以AMP-Na 200mg/kgⅠ和260mg/kg作用最強(qiáng),與溶媒對(duì)照比,差別有極顯著性(P＜0.01);與卡鉑單用比,差別有顯著性(P＜0.05)。
2、體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AMP-Na 6.25～200μg/ml對(duì)人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞增殖的抑制作用具有明顯的量效關(guān)系,與CBP聯(lián)用后有協(xié)同效應(yīng),可顯著增加CBP對(duì)SPC-A-1細(xì)胞的抑制作用,卡鉑單用的IC50為35.69μg/ml±6.56μg/ml,聯(lián)用后依次降為33.98±6.3、30.96±3.8、28.34±6.3、19.13±6.9和＜6.25μg/ml。
3、FCM分析顯示,AMP-Na 12.5～100μg/ml各劑量單用對(duì)人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞具有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用,與陰性對(duì)照比,差別有顯著性(P＜0.05);和CBP聯(lián)用后凋亡率較卡鉑單用明顯上升,有協(xié)同抑制作用。
4、FCM分析顯示,AMP-Na單用及與CBP聯(lián)合作用后可顯著提高SPC-A-1細(xì)胞Bcl-2與Bax的平均熒光強(qiáng)度,降低Bcl-2/Bax的比率,增加Caspase-3的表達(dá)。
結(jié)論：
1、AMP-Na單用對(duì)人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)無(wú)明顯影響;AMP-Na與卡鉑合用,可以增強(qiáng)卡鉑對(duì)裸鼠移植瘤的抗腫瘤活性,有協(xié)同抑制作用。
2、AMP-Na單用能夠顯著抑制人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞的增殖,且有濃度依賴性;AMP-Na與卡鉑合用可以增強(qiáng)卡鉑的活性,協(xié)同抑制SPC-A-1細(xì)胞的增殖。
3、AMP-Na可能是通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,降低凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax的比率,誘導(dǎo)凋亡而發(fā)揮其抗腫瘤作用。
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