一、背景
急性早幼粒細(xì)胞株來源1989年第二次復(fù)發(fā)的急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL；FAB命名法中的M3）患者的骨髓。
二、急性早幼粒細(xì)胞株培養(yǎng)步驟
1）復(fù)蘇急性早幼粒細(xì)胞株細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）急性早幼粒細(xì)胞株細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于懸浮急性早幼粒細(xì)胞株細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1、收集急性早幼粒細(xì)胞株細(xì)胞，1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄上清液，補(bǔ)加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或瓶中。
2、可選擇半數(shù)換液方式，棄半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基新皿中或者瓶中。
3）急性早幼粒細(xì)胞株細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。棄培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，進(jìn)行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入到凍存液中。
三、應(yīng)用
急性早幼粒細(xì)胞株可以用于低劑量PRF誘導(dǎo)的人急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞自噬與分化的作用機(jī)制：
探討低劑量PRF誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞自噬在NB4細(xì)胞生存及轉(zhuǎn)歸中的作用,利用自噬以及MEK/ERK相關(guān)信號(hào)分子的變化等揭示可能的分子機(jī)制。
研究方法：
1、低劑量PRF對(duì)NB4細(xì)胞自噬表達(dá)的影響NB4細(xì)胞經(jīng)梯度濃度(0、5、10、15μg/ml)PRF處理48h,采用蛋白免疫印跡法(Western Blot,WB)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1的表達(dá)變化;qRT-PCR(quantitative Real-time PCR)技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)基因ATG5、Beclin1的表達(dá)變化;10μg/mlPRF作用48h后,單丹磺酰尸胺(MDC)染色及透射電鏡技術(shù)檢測(cè)NB4細(xì)胞中自噬小體的變化。
2、自噬在低劑量PRF誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化的作用NB4細(xì)胞經(jīng)3MA(5mM)預(yù)處理1h后,再給予PRF(10μg/ml)作用48h,采用WB檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1以及PML-RARα融合蛋白的表達(dá)變化;采用瑞士-吉姆薩染色(Giemsa-Wright’s staining)檢測(cè)NB4細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變情況;采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)來檢測(cè)NB4細(xì)胞表面分化抗原CD1 1b的表達(dá)陽(yáng)性率以及細(xì)胞改變。
3、低劑量PRF誘導(dǎo)NB4細(xì)胞自噬及分化可能的分子機(jī)制NB4細(xì)胞經(jīng)10μg/mlPRF作用48h后,運(yùn)用WB檢測(cè)MEK和ERK1蛋白的表達(dá)水平。采用該通路抑制劑SCH772984(10μM)預(yù)處理NB4細(xì)胞1h后,再給予10μg/mlPRF作用48h,WB檢測(cè)ERK1、LC3-Ⅱ、PML-RARα蛋白表達(dá)的變化;MDC染色和Giemsa-Wright’s staining觀察NB4細(xì)胞中酸性自噬溶酶體和細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化;運(yùn)用FCM檢測(cè)NB4細(xì)胞表面分化抗原CD1 1b的表達(dá)以及細(xì)胞周期變化;qRT-PCR技術(shù)分析不同濃度梯度(0、5、10、15μg/ml)PRF作用48h后的NB4細(xì)胞以及抑制劑SCH772984(10μM)預(yù)處理后ERK1、LC3-Ⅱ、PML-RARα在mRNA水平的表達(dá)。
研究結(jié)果：
1、PRF體外可誘導(dǎo)NB4細(xì)胞自噬。PRF(10μg/ml)藥物作用48h后自噬水平提升明顯,自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ及Beclin1的表達(dá)升高;ATG5及Beclin1在mRNA水平表達(dá)增多;PML-RARα融合蛋白在mRNA水平表達(dá)減少;細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量增多。
2、自噬抑制劑3MA(5mM)預(yù)處理1h,再予以PRF(10μg/ml)作用48h后,自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1的表達(dá)下調(diào),融合蛋白PML-RARα的表達(dá)下調(diào),Beclin1、LC3-Ⅱ、MEK、ERK1在mRNA水平表達(dá)減少,PML-RARα融合蛋白在mRNA水平表達(dá)增多;抑制NB4細(xì)胞向正常粒細(xì)胞分化的形態(tài)學(xué)也發(fā)生改變,阻斷自噬也降低了PRF誘導(dǎo)的CD11b表達(dá)下降,抑制了細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期的現(xiàn)象。
3、PRF(10μg/ml)作用NB4細(xì)胞48h后可顯著上調(diào)MEK和ERK1的蛋白表達(dá)水平。通路抑制劑SCH772984(10μM)預(yù)處理1h后,10μg/ml PRF誘導(dǎo)的ERK1、LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)及PML-RARα的降解程度均受抑,Beclin1、LC3-Ⅱ、MEK、ERK1在mRNA水平表達(dá)減少,PML-RARα融合蛋白在mRNA水平表達(dá)增多;NB4細(xì)胞中酸性自噬溶酶體比例下降,抑制細(xì)胞形態(tài)改變,表面分化抗原CD11b表達(dá)下調(diào),表明NB4細(xì)胞分化受阻。
結(jié)論：低劑量(10μg/ml)PRF通過激活MEK/ERK信號(hào)通路促進(jìn)NB4細(xì)胞的自噬,引起致癌蛋白PML-RARα的降解,最終誘導(dǎo)NB4細(xì)胞向正常粒細(xì)胞分化。低劑量(10μg/ml)PRF誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞自噬與分化之間的關(guān)系有待進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
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