一、背景
大鼠子宮成纖維細(xì)胞是一種在特定實驗室條件下培養(yǎng)的細(xì)胞。它們是從新鮮的大鼠組織中分離出來的，可以用于各種實驗研究。這些細(xì)胞通常用于研究子宮的生物學(xué)和生理學(xué)特性，以及與子宮相關(guān)的疾病和治療方法。
大鼠子宮成纖維細(xì)胞具有特定的形態(tài)和功能特征，包括細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞成分、生長和繁殖方式等。在實驗室中，這些細(xì)胞通常在特定的培養(yǎng)基中生長，以提供最佳的生長條件，并需要適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)、溫度和濕度等環(huán)境因素。
二、大鼠子宮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1、大鼠子宮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備基礎(chǔ)培養(yǎng)基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸鈉0.11g/L)；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。
2）大鼠子宮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。
2、大鼠子宮成纖維細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）大鼠子宮成纖維細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）大鼠子宮成纖維細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。
三、應(yīng)用
大鼠子宮成纖維細(xì)胞可以用于體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向子宮韌帶成纖維細(xì)胞分化的研究：
在體外通過非接觸式共培養(yǎng)誘導(dǎo)BMSCs向子宮韌帶成纖維細(xì)胞的分化,為從組織工程學(xué)角度以根源上治療PFD疾病提供可能的研究思路及新的治療手段。
研究方法：
1、大鼠BMSCs的體外分離培養(yǎng)：采用密度梯度離心法結(jié)合傳代貼壁篩選法分離純化獲得大鼠BMSCs;通過形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞生長曲線繪制、細(xì)胞表面特異抗原及細(xì)胞周期的流式細(xì)胞學(xué)檢測,對體外培養(yǎng)獲得的BMSCs進(jìn)行初步鑒定；采用體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞的分化,對獲得的BMSCs的生物學(xué)功能進(jìn)行鑒定。
2、大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定：采用大鼠子宮韌帶組織塊酶消化法,進(jìn)行子宮韌帶成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng),通過形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞生長曲線的繪制及免疫組化測定其膠原Ⅰ、Ⅲ蛋白的表達(dá)對獲得的子宮韌帶成纖維細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
3、對大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外機(jī)械牽張,建立機(jī)械牽張損傷模型：根據(jù)韌帶成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性,在細(xì)胞牽張儀上采用負(fù)載10%應(yīng)力,1赫茲的機(jī)械牽張刺激大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞3h、6h、12h、24h、36h不同時間段后,通過透射電鏡、鬼筆環(huán)肽染色觀察不同時間牽張損傷后成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架的變化情況；采用實時定量RT-PCR技術(shù)測定不同時間牽張損傷后成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的合成能力；用臺盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞的凋亡情況。
4、大鼠BMSCs與大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立：將大鼠BMSCs與正常及不同牽張時間后的大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng)3、6、12天,采用實時定量RT-PCR檢測BMSCs中彈性蛋白、LOX及Fibulin-5 mRNA的表達(dá)情況；采用免疫蛋白印記法(western-blot)檢測BMSCs中彈性蛋白、LOX及Fibulin-5蛋白的合成情況。應(yīng)用SPSS16.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有數(shù)據(jù)結(jié)果均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示。用one-way ANOVA檢驗樣本與對照組的組間差異,以a=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。
實驗結(jié)果：
1、體外獲得的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),其細(xì)胞形態(tài)均一,呈梭形、扁平形,增殖至細(xì)胞融合時,細(xì)胞為典型的長梭形,呈集落樣或放射狀排列,有一定的極性;檢測第四代大鼠BMSCs表面特異抗原分子,99.0%以上細(xì)胞CD90表達(dá)陽性,98.8%以上的細(xì)胞CD44表達(dá)陽性,CD34、CD45均表達(dá)陰性,分別為1.8%和3.7%；細(xì)胞周期結(jié)果顯示：第4代BMSCs處于G0/G1期的細(xì)胞約為80%以上,表明大多數(shù)細(xì)胞處于靜止期；細(xì)胞生長曲線典型,且所得細(xì)胞可被誘導(dǎo)為成骨和成脂細(xì)胞,符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。
2、體外成功獲得子宮韌帶成纖維細(xì)胞,細(xì)胞貼壁生長,形態(tài)呈梭形,與典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)相似；細(xì)胞生長曲線典型,免疫組化測定其膠原Ⅰ、Ⅲ型蛋白的表達(dá)均符合韌帶成纖維細(xì)胞特征。
3、本實驗以1Hz的強(qiáng)度,負(fù)載10%牽張刺激細(xì)胞,用熒光物質(zhì)(鬼筆環(huán)肽和DAPI)分別對所得細(xì)胞內(nèi)F-actin和細(xì)胞核進(jìn)行特異性標(biāo)記,結(jié)果提示：F-actin在機(jī)械牽張下發(fā)生了解聚和重排。力學(xué)牽張短時間內(nèi)子宮韌帶成纖維細(xì)胞未出現(xiàn)明顯變化,長時間刺激后細(xì)胞變狹長,排列無序,超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷,甚至出現(xiàn)凋亡。
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