一、背景
魯氏不動(dòng)桿菌PCR試劑盒適用于各種RNA制品的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及隨后的PCR擴(kuò)增。它采用M-MLV進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，能夠獲得較長(zhǎng)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。同時(shí)，在20ul反轉(zhuǎn)錄體系和50ul PCR反應(yīng)體系中，還可以一次性得到足夠量的PCR產(chǎn)物用于后續(xù)的克隆實(shí)驗(yàn)。
二、魯氏不動(dòng)桿菌PCR試劑盒使用方法
（一）樣品DNA的制備
1、用自選方法純化N+2個(gè)樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送20次核酸釋放劑試用裝，其使用手冊(cè)可以從本公司網(wǎng)站訂購核酸釋放劑。
2、如果有N個(gè)樣品，則需要做N+2個(gè)提取，包括一個(gè)樣品制備陽性對(duì)照和一個(gè)樣品制備陰性對(duì)照。樣品制備陽性對(duì)照是在適量水（取決于試劑盒要求的樣品起始量）中加10μL魯氏不動(dòng)桿菌PCR陽性對(duì)照的1000倍稀釋液而得，樣品制備陰性對(duì)照是直接用水。提取結(jié)束后最后得到模板DNA放冰上待用。
（二）設(shè)置PCR反應(yīng)（40μL體系）
3、對(duì)N+2個(gè)樣品，在PCR時(shí)需要增加一個(gè)PCR陽性對(duì)照和一個(gè)PCR陰性對(duì)照，故需要設(shè)置N+4個(gè)反應(yīng)。
（三）電泳檢測(cè)
4、取10-20μL PCR產(chǎn)物。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。本產(chǎn)品提供的PCR Mix在擴(kuò)增結(jié)束后可以直接上樣，不需要另外再加loading buffer。PCR產(chǎn)物陽性對(duì)照必須有預(yù)期條帶出現(xiàn)，陰性對(duì)照必須無任何擴(kuò)增，否則實(shí)驗(yàn)無效。對(duì)沒有擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品，可以稀釋10倍后重復(fù)PCR擴(kuò)增以排除PCR抑制劑的感染。
三、應(yīng)用
魯氏不動(dòng)桿菌PCR試劑盒可以用于基于微生物組學(xué)和代謝組學(xué)的腺性膀胱炎發(fā)病機(jī)制研究：
建立基于差異菌群、差異代謝物的疾病診斷模型。分析差異菌群與差異代謝物之間的相關(guān)關(guān)系,闡釋腺性膀胱炎的發(fā)病機(jī)制。
材料與方法：
1、生物樣本收集。主要包括腺性膀胱炎患者及正常對(duì)照人群的尿液、糞便及血液標(biāo)本的收集。腺性膀胱炎患者的入組標(biāo)準(zhǔn)為：
(1)病理確診為腺性膀胱炎;
(2)因性別因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本研究全部納入男性患者;
(3)年齡在20-70歲之間;(4)BMI要求在18.5-24之間;(5)簽署知情同意書,并經(jīng)上海長(zhǎng)海醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)認(rèn)證。
正常對(duì)照組的入組標(biāo)準(zhǔn)為：
(1)2017年1月至2018年12月期間于上海長(zhǎng)海醫(yī)院體檢中心體檢,體檢結(jié)果正常;
(2)全部納入男性;
(3)年齡在20-70歲之間;(4)BMI要求在18.5-24之間;(5)簽署知情同意書,并經(jīng)上海長(zhǎng)海醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)認(rèn)證。近1個(gè)月內(nèi)接受抗生素治療或長(zhǎng)期食用益生菌類食品的腺性膀胱炎患者或健康人均不能納入本研究中。
2、微生物多樣性測(cè)序：
(1)基因組DNA抽提和質(zhì)檢使用基因組DNA抽提試劑盒提取尿液、糞便、血液標(biāo)本的基因組DNA,提取方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。基因組DNA完成提取后,利用紫外微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量。
(2)引物的設(shè)計(jì)合成細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增選擇區(qū)域?yàn)閂3-V4區(qū),使用的通用引物為341F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。
(3)PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化以稀釋后的基因組DNA為模板,使用魯氏不動(dòng)桿菌PCR試劑盒對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。切取目的片段后采用凝膠回收試劑盒回收目的片段。
(4)PCR產(chǎn)物的定量化、均一化對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量,根據(jù)單個(gè)樣品所需的數(shù)據(jù)量要求,按照相應(yīng)比例進(jìn)行混合。
(5)上機(jī)測(cè)序利用Illumina公司的Miseq平臺(tái)進(jìn)行微生物多樣性測(cè)序,而后進(jìn)行生物信息學(xué)分析。將獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和質(zhì)控,將Reads按照豐度由大到小排列,得到運(yùn)算分類單元(OTUs),然后對(duì)每個(gè)樣品的Reads進(jìn)行隨機(jī)抽平,接下來進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)稀釋曲線分析,對(duì)每個(gè)OTU進(jìn)行物種分類。分類后,依據(jù)每個(gè)OTU中序列的條數(shù)得到OTU豐度表,依據(jù)OTU豐度表進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析。
(6)生物信息學(xué)分析微生物多樣性測(cè)序的生物信息學(xué)分析主要包括對(duì)各個(gè)樣本在不同分類水平的組成進(jìn)行分析;分析不同樣本間及不同分組間的菌群結(jié)構(gòu)的差異;根據(jù)差異菌群,構(gòu)建疾病的診斷模型并評(píng)估模型的診斷效能;依據(jù)16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果,預(yù)測(cè)樣本的菌群代謝功能。
3、代謝物組學(xué)分析：
(1)生物樣本收集主要包括腺性膀胱炎患者及正常對(duì)照人群的尿液及糞便標(biāo)本的收集。腺性膀胱炎患者及健康正常人的入組標(biāo)準(zhǔn)同上述微生物學(xué)多樣性測(cè)序中的入組標(biāo)準(zhǔn)。
(2)上機(jī)檢測(cè)尿液代謝組學(xué)分析采用LC-MS分析,LC-MS分析使用Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜與Agilent 6538 UHD and Accurate-Mass Q-TOF質(zhì)譜聯(lián)用儀。菌群與宿主腸道共代謝物檢測(cè)使用的儀器是氣相色譜—飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC-TOFMS,Pegasus HT,Leco Corp.,St.Joseph,MO,USA)
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