一、背景
絨猴EBV轉(zhuǎn)化的白細(xì)胞源自暴露于人白血球中抽提的EB病毒的絨猴白血球；B95-8細(xì)胞是一個(gè)連續(xù)株，并能釋放高滴度的轉(zhuǎn)染EB病毒。此細(xì)胞提供EB病毒用于建立人的連續(xù)淋巴細(xì)胞株。
二、絨猴EBV轉(zhuǎn)化的白細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程
1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備:
1)準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640:GIBCO),90%;優(yōu)質(zhì)胎牛血清,10%。
2)培養(yǎng)條件:氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。溫度:37℃,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3)凍存液:90%血清,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配,液氮儲(chǔ)存。
2、絨猴EBV轉(zhuǎn)化的白細(xì)胞處理:
1)復(fù)蘇細(xì)胞:將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中(水面要低于凍存管蓋部)搖晃解凍,移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)細(xì)胞傳代:如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于懸浮細(xì)胞,傳代可參考以下方法:
方法一:收集細(xì)胞,1000RPM,常溫條件下離心5分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
方法二:可選擇半數(shù)換液方式,棄去半數(shù)培養(yǎng)基后,將剩余細(xì)胞懸起,將細(xì)胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3)絨猴EBV轉(zhuǎn)化的白細(xì)胞凍存:待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),可進(jìn)行細(xì)胞凍存。懸浮細(xì)胞凍存時(shí),應(yīng)將細(xì)胞收集,1000RPM,常溫條件下離心5分鐘,少量保存上清液(防止細(xì)胞吸走),加入部分新鮮培養(yǎng)基,吹打均勻后,加入到凍存管中,在凍存管中加入10%DMSO搖勻后進(jìn)行凍存。
三、應(yīng)用
絨猴EBV轉(zhuǎn)化的白細(xì)胞可以用于鎖核酸核酶抑制EBV-LMP1基因表達(dá)及其對(duì)B95-8細(xì)胞生物學(xué)影響初步研究：
B95-8細(xì)胞系是一種由暴露于人白血球中抽提的EB病毒的絨猴白細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來的連續(xù)株細(xì)胞系。該細(xì)胞系可以用于產(chǎn)生EB病毒，以用于建立人的連續(xù)淋巴細(xì)胞株。
針對(duì)鼻咽癌EBV-LMP1的高效10～23型DZ167為基礎(chǔ)，經(jīng)LNA修飾設(shè)計(jì)合成LANzyme，以EBV-LMP1陽(yáng)性的B95-8細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，比較DZ167和LNA167對(duì)LMP1表達(dá)的抑制作用，并觀察其對(duì)B95-8細(xì)胞生物學(xué)的影響。
根據(jù)前期篩選的脫氧核酶DZ167為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)合成鎖核酸核酶LAN167，比較DZ167、LAN167對(duì)B95-8細(xì)胞靶基因EBV-LMP1的抑制效應(yīng)。
方法：以B95-8為原型，EBV-LMP1基因?yàn)橐种瓢悬c(diǎn)，設(shè)計(jì)合成脫氧核酶DZ167，對(duì)其5’端及3’端前2個(gè)結(jié)合臂分別進(jìn)行硫代化修飾或引入2個(gè)LNA單體，并設(shè)計(jì)無催化活性中心的無序DNAzyme對(duì)照序列，所有序列5’端用FITC標(biāo)記。經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染B95-8細(xì)胞，分為硫代修飾DZ167組（S-DZ167）、鎖核酸核酶LNA167組、無序DZ167組。同時(shí)設(shè)立未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后24h，熒光顯微鏡觀察活細(xì)胞中熒光的分布情況，流式細(xì)胞儀測(cè)轉(zhuǎn)染率。轉(zhuǎn)染12h、24h、48h、72h及96h，采用Real-Time PCR評(píng)價(jià)S-DZ167、LNA167對(duì)LMP1穩(wěn)定性及抑制時(shí)效關(guān)系。轉(zhuǎn)染后48h采用Western blot方法檢測(cè)LNA167、S-DZ167對(duì)EBV-LMP1蛋白表達(dá)的抑制情況。
結(jié)果：轉(zhuǎn)染后24h，熒光顯微鏡觀察各組均有綠色熒光表達(dá)，核酶主要分布于細(xì)胞漿、細(xì)胞膜。無序DZ167組、S-DZ167組、LNA167組轉(zhuǎn)染效率分別為75.5%、76.7%及77.6%。
對(duì)LMP1穩(wěn)定性及抑制時(shí)效關(guān)系評(píng)價(jià)結(jié)果示：與未轉(zhuǎn)染組相比，LNA167組及S-DZ167組于轉(zhuǎn)染后12h、24h、48h、72h對(duì)96h，LMP1均保持一定的抑制效應(yīng)，抑制率分別為，23.73%，33.93%，44.89%，27.45%，12.24%；45.76%，51.79%，71.43%，54.90%，22.45%。轉(zhuǎn)染12h，LNA167及S-DZ167就表現(xiàn)出對(duì)LMP1的抑制作用，以48h最明顯，之后逐漸下降；轉(zhuǎn)染72h后，LNA167組與S-DZ167組抑制率相比，差異有顯著性（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染至96h，仍然表現(xiàn)出對(duì)LMP1mRNA一定抑制效應(yīng)，與未轉(zhuǎn)染組相比，LNA167組差異有顯著性（P＜0.05），而S-DZ167組差異無顯著性（P＞0.05），兩組相比雖然差異無顯著性（P＞0.05），但LNA167組對(duì)LMP1mRNA抑制程度仍高于S-DZ167組。
未轉(zhuǎn)染組與無序DZ167相比差異均無顯著性（P＞0.05）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：與未轉(zhuǎn)染組比較，無序DZ167組對(duì)EBV-LMP1蛋白表達(dá)抑制率為5.89%，差異無顯著性（P＞0.05）；LNA167、S-DZ167對(duì)EBV-LMP1蛋白抑制率分別為49%、75.02%，LNA167與S-DZ167能不同程度地抑制EBV-LMP1蛋白，但LNA167抑制效應(yīng)明顯高于S-DZ167，差異有顯著性（P＜0.05）。
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