一、背景
耐久腸球菌PCR試劑盒是一種用于檢測(cè)耐久腸球菌的分子生物學(xué)試劑盒。耐久腸球菌PCR試劑盒使用染料法或探針?lè)晒舛縋CR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，具有更高的靈敏度和特異性。
耐久腸球菌PCR試劑盒可進(jìn)行50次PCR檢測(cè)，適用于無(wú)內(nèi)毒素試管中的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。它具有以下特點(diǎn)：即開(kāi)即用，只需提供DNA模板；引物經(jīng)過(guò)精心優(yōu)化，專(zhuān)一性強(qiáng)，只擴(kuò)增耐久腸球菌，與其他微生物沒(méi)有交叉反應(yīng)；提供陽(yáng)性對(duì)照等。
二、耐久腸球菌PCR試劑盒原理
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限,實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度,并記錄在電腦軟件之中,通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí),剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對(duì)數(shù)期),此時(shí)微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性極好,即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定,因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴(lài)的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確,重現(xiàn)性的定量方法,已得到全世界的公認(rèn),廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。定量PCR除可以對(duì)樣品的初始濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量外,還有其它多種豐富的應(yīng)用。還包括基因表達(dá)調(diào)控情況的分析、等位基因的分析等。
三、應(yīng)用
耐久腸球菌PCR試劑盒可以用于飼草青貯微生物菌群動(dòng)態(tài)變化與乳酸菌的鑒定篩選：
以玉米、苜蓿和直穗鵝觀草為材料,開(kāi)展單獨(dú)青貯和混合青貯發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群特性的研究,主要結(jié)論如下:
(1)乳酸菌、好氧細(xì)菌、大腸桿菌、酵母及霉菌存在于青貯原料、青貯發(fā)酵過(guò)程中和發(fā)酵完成后等所有時(shí)期,不同時(shí)期的數(shù)量有較大差異;青貯原料上附生的乳酸菌數(shù)量遠(yuǎn)少于有害微生物的數(shù)量;除玉米外,各原料表面附生乳酸菌數(shù)量均未達(dá)到105 cfu/g FM,且玉米上附生的乳酸菌數(shù)量遠(yuǎn)多于苜蓿和直穗鵝觀草;同一茬次苜蓿不同品種間附生的乳酸菌數(shù)量無(wú)明顯差異;不同茬次甘農(nóng)3號(hào)苜蓿上附生的乳酸菌數(shù)量基本沒(méi)有變化,但第二茬上的有害微生物顯著增多;隨著原料含水量的下降,苜蓿表面的乳酸菌逐漸增多,有害微生物的數(shù)量逐漸減少。
(2)發(fā)酵開(kāi)始后,各種微生物較青貯原料上的起始菌落數(shù)均有較大增長(zhǎng);發(fā)酵過(guò)程中各種微生物的數(shù)量基本都存在緩慢變化、迅速增長(zhǎng)、達(dá)到值后下降、最后穩(wěn)定在較低水平的變化過(guò)程,受原料特性、發(fā)酵條件、添加劑等的影響,有的原料微生物數(shù)量在青貯過(guò)程中出現(xiàn)兩次甚至三次升降變化;不同微生物開(kāi)始迅速增殖、達(dá)到值的時(shí)間可能相同也可能不同,不同微生物數(shù)量的值也不相同;混貯原料特性、配比等也影響發(fā)酵過(guò)程中各類(lèi)微生物的數(shù)量、值及達(dá)到值的時(shí)間;有的青貯在發(fā)酵完成后出現(xiàn)各種微生物數(shù)量激增的現(xiàn)象;發(fā)酵過(guò)程中,乳酸菌數(shù)量的值為109.50～1010.38 cfu/g FM,值出現(xiàn)在發(fā)酵15天或20天。
(3)發(fā)酵過(guò)程中,第二茬甘農(nóng)3號(hào)苜蓿青貯中各類(lèi)微生物的數(shù)量總體上多于茬,且達(dá)到峰值的時(shí)間較早,峰值較小;總體而言,苜蓿青貯中各類(lèi)微生物的數(shù)量較高,直穗鵝觀草次之,玉米較少;隨著含水量的降低,苜蓿青貯中各類(lèi)微生物的數(shù)量逐漸減少;添加糖蜜可以促進(jìn)乳酸菌的繁殖;乳酸菌的數(shù)量在自然青貯發(fā)酵過(guò)程中不具優(yōu)勢(shì),其數(shù)量與好氧細(xì)菌、酵母與霉菌等的數(shù)量相當(dāng);大腸桿菌的數(shù)量遠(yuǎn)少于其他各類(lèi)微生物的數(shù)量。
(4)從青貯原料、青貯發(fā)酵初期和后期分離出54株乳酸菌,這些菌株分屬于5個(gè)屬的10個(gè)菌種,包括戊糖片球菌、植物乳桿菌、屎腸球菌、乳酸片球菌、希氏腸球菌、蒙氏腸球菌、融合魏斯氏菌、腸膜明串珠菌腸膜亞種、耐久腸球菌（使用耐久腸球菌PCR試劑盒鑒定）和彎曲乳桿菌,其中戊糖片球菌、植物乳桿菌和屎腸球菌較多。
(5)篩選出GI7、GI11、GI24、GI44、GI62等5株產(chǎn)酸速率較快的菌株,其中植物乳桿菌GI62產(chǎn)酸速率和生長(zhǎng)速度較快,最適合用作青貯乳酸菌添加劑菌種;使用乳酸菌添加劑能夠增加苜蓿青貯中乳酸菌的數(shù)量,降低pH值,處理組植物乳桿菌GI62+戊糖片球菌GI11+乳酸片球菌GI7效果。
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