一、背景
A101D人黑色素瘤貼壁細(xì)胞系是一種來(lái)源于人類黑色素瘤的貼壁細(xì)胞系。這種細(xì)胞系是通過將人類黑色素瘤組織移植到裸鼠體內(nèi)，然后從移植瘤中分離出的一種細(xì)胞系。
二、A101D人黑色素瘤貼壁細(xì)胞系具有以下特點(diǎn)
貼壁生長(zhǎng)：該細(xì)胞系在培養(yǎng)基上能夠貼壁生長(zhǎng)，形成單層或多層的細(xì)胞集落。
高增殖能力：該細(xì)胞系具有較高的增殖能力，可以在短時(shí)間內(nèi)快速擴(kuò)增。
表達(dá)多種腫瘤相關(guān)基因：該細(xì)胞系表達(dá)多種與黑色素瘤相關(guān)的基因，如MITF、TYR、MC1R等。
對(duì)藥物敏感性較高：該細(xì)胞系對(duì)某些化療藥物和靶向藥物具有較高的敏感性，可以用于藥物篩選和治療策略的研究。
三、A101D人黑色素瘤貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)步驟
1）復(fù)蘇A101D人黑色素瘤貼壁細(xì)胞系細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）A101D人黑色素瘤貼壁細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
3）A101D人黑色素瘤貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。棄培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，進(jìn)行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入到凍存液中。
四、應(yīng)用
A101D人黑色素瘤貼壁細(xì)胞系可以用于光動(dòng)力治療對(duì)黑色素瘤細(xì)胞侵襲、增殖能力的影響及其機(jī)制研究：
以小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10和A101D人黑色素瘤貼壁細(xì)胞系進(jìn)行研究,研究5-ALA-PDT對(duì)黑色素瘤細(xì)胞系遷移和侵襲能力的影響及其機(jī)制,同時(shí)也探查了光敏劑5-ALA促進(jìn)PDT從而影響黑色素瘤細(xì)胞的增殖的相關(guān)機(jī)制,為光動(dòng)力治療黑色素瘤提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。
ALA-PDT抑制A101D人黑色素瘤貼壁細(xì)胞系和B16-F10(鼠)遷移和侵襲及其機(jī)制研究：1、ALA-PDT抑制黑色素瘤細(xì)胞A375和B16-F10體外遷移和侵襲能力:利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)黑色素瘤細(xì)胞遷移能力時(shí)發(fā)現(xiàn),2.4J、4.8J ALA-PDT分別處理B16-F10和A101D人黑色素瘤貼壁細(xì)胞系12h及24h后的遷移率相比較空白對(duì)照組明顯降低(p<0.001)。
同時(shí)利用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)黑色素瘤細(xì)胞侵襲能力,
結(jié)果顯示：2.4J、4.8J ALA-PDT處理24h后,B16-F10和A101D人黑色素瘤貼壁細(xì)胞系通過Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量少于空白對(duì)照組A375細(xì)胞侵襲數(shù)目(p<0.001)。2.ALA-PDT處理后,A375、B16-F10自分泌炎癥因子mRNA的下調(diào):
2、4J、4.8J ALA-PDT分別處理B16-F10和A375細(xì)胞12h及24h后對(duì)兩種細(xì)胞自分泌炎癥因子IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-βm RNA水平進(jìn)行染料q-PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在光動(dòng)力治療能量及時(shí)間對(duì)兩種細(xì)胞系炎癥因子分泌的影響都呈現(xiàn)一定劑量依賴的關(guān)系,但僅TGF-βm RNA水平在兩株細(xì)胞內(nèi)均有不同程度下調(diào)(P<0.05)。
ALA-PDT處理后,A375、B16-F10自分泌炎癥因子蛋白的下調(diào):2.4J、4.8J ALA-PDT分別處理B16-F10和A375細(xì)胞12h及24h后對(duì)A375、B16-F10自分泌炎癥因子IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β蛋白水平進(jìn)行ELISA檢測(cè),與mRNA定量檢測(cè)結(jié)果一致,光動(dòng)力治療能量及時(shí)間對(duì)兩種細(xì)胞分泌到胞外炎癥因子的水平的影響同樣呈現(xiàn)一定劑量依賴的關(guān)系,僅TGF-β有不同程度下調(diào)(P<0.05)。
外源性添加TGF-β逆轉(zhuǎn)了PDT對(duì)A375、B16-F10遷移和侵襲的能力的抑制:回補(bǔ)10ng/ml TGF-β進(jìn)行反向驗(yàn)證,分組為:空白對(duì)照組、TGF-β組、4.8J PDT組,4.8J PDT+TGF-β組,使用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)回補(bǔ)TGF-β逆轉(zhuǎn)PDT對(duì)A375、B16-F10遷移能力的抑制(P<0.05);使用Transwell小室檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)回補(bǔ)TGF-β逆轉(zhuǎn)PDT對(duì)A375、B16-F10細(xì)胞侵襲能力的抑制(P<0.05)。
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