一、背景
CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系是一種來(lái)源于人舌鱗癌組織的貼壁細(xì)胞系。這種細(xì)胞系在培養(yǎng)過(guò)程中能夠保持其生物學(xué)特性，并可用于研究人舌鱗癌的發(fā)生、發(fā)展、治療和藥物篩選等方面的實(shí)驗(yàn)。
CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系的保存條件通常為低溫避光，并且需要在高純度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。這種細(xì)胞系具有一定的異質(zhì)性，可以作為研究其他腫瘤細(xì)胞的模型之一。
二、CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系可以用于辛伐他汀通過(guò)鈣激活氯通道TMEM16A抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖的機(jī)制研究：
通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TMEM16A在口腔鱗癌中的表達(dá)和臨床意義,研究TMEM16A對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖的影響,以及辛伐他汀對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制。
研究方法：通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中305例口腔鱗癌標(biāo)本和30例癌旁組織標(biāo)本的臨床數(shù)據(jù)和TMEM16A m RNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中40對(duì)口腔鱗癌標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本的TMEM16A m RNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。對(duì)84例口腔鱗癌組織切片及12例正?？谇火つそM織切片的免疫組織化學(xué)染色分析并結(jié)合患者的臨床資料,來(lái)研究TMEM16A在口腔鱗癌組織與非癌組織中的表達(dá)差異及其與口腔鱗癌患者各項(xiàng)臨床指標(biāo)的關(guān)系。
通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)驗(yàn)證TMEM16A在CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系中是否介導(dǎo)鈣激活氯電流。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)分別研究敲低TMEM16A、TMEM16A抑制劑、過(guò)表達(dá)TMEM16A對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖的影響。通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究不同濃度的辛伐他汀對(duì)CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系中TMEM16A通道功能的影響。通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)研究辛伐他汀對(duì)CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞中TMEM16A蛋白表達(dá)量的影響。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)研究辛伐他汀對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27、CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系和人永生化表皮細(xì)胞Ha Ca T細(xì)胞增殖的影響。
通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)研究不同濃度的辛伐他汀對(duì)CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞增殖的影響以及加入過(guò)量MVA、敲低TMEM16A或過(guò)表達(dá)TMEM16A對(duì)辛伐他汀增殖抑制作用的影響。結(jié)果:數(shù)據(jù)庫(kù)生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,口腔鱗癌組織中TMEM16A m RNA的表達(dá)量顯著高于癌旁組織。TMEM16A m RNA的表達(dá)量與口腔鱗癌患者的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期顯著相關(guān)。T3與T4分期、N1-N3分期、臨床分期Ⅲ期及Ⅳ期的口腔鱗癌患者中TMEM16A m RNA的表達(dá)量分別高于T1與T2分期、N0分期、臨床分期Ⅰ期及Ⅱ期的口腔鱗癌患者。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果表明,TMEM16A m RNA高表達(dá)的口腔鱗癌患者的總生存時(shí)間顯著低于TMEM16A m RNA低表達(dá)的患者。
免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明,口腔鱗癌組織中TMEM16A蛋白的表達(dá)量顯著高于正?？谇火つそM織。TMEM16A蛋白的表達(dá)量與口腔鱗癌患者的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期顯著相關(guān)。T3與T4分期、N1-N3分期、臨床分期Ⅲ期及Ⅳ期的口腔鱗癌患者中TMEM16A蛋白的表達(dá)量分別高于T1與T2分期、N0分期、臨床分期Ⅰ期及Ⅱ期的口腔鱗癌患者。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果表明,TMEM16A蛋白高表達(dá)的口腔鱗癌患者的總生存時(shí)間顯著低于TMEM16A蛋白低表達(dá)的患者。TMEM16A在CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系中介導(dǎo)鈣激活氯電流。TMEM16A的敲低、TMEM16A的抑制劑T16Ainh-A01(20μM)可以顯著抑制CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞的增殖。TMEM16A過(guò)表達(dá)可以顯著促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27的增殖。
辛伐他汀可以顯著抑制CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞中的鈣激活氯電流,且抑制效果呈現(xiàn)劑量依賴性。辛伐他汀的IC50為5.605±1.512μM。此外,辛伐他汀(10μM)對(duì)CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞中TMEM16A的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著的影響。辛伐他汀(10μM)可以顯著的抑制口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27和CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系的細(xì)胞增殖,對(duì)Ha Ca T細(xì)胞的增殖沒(méi)有顯著的影響。辛伐他汀(10μM)對(duì)CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。加入過(guò)量的MVA(500μM)可以顯著減少辛伐他汀對(duì)CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞的增殖抑制作用。TMEM16A的敲低可以顯著減少辛伐他汀對(duì)CAL-33人舌磷癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞的增殖抑制作用。TMEM16A過(guò)表達(dá)可以顯著的提高辛伐他汀對(duì)CAL-27細(xì)胞的增殖抑制作用。
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