一、背景
HPDE6-C7人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞來源于是一個由正常人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞（HPDE）衍生的永生化上皮細(xì)胞系。HPDE6-C7細(xì)胞系的科研應(yīng)用廣泛，常用于3D細(xì)胞培養(yǎng)的研究。
二、HPDE6-C7人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞收到后處理
細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是細(xì)胞運輸?shù)暮棉k法。收到細(xì)胞回到自己的實驗室后，先打開外包裝，用75%酒精噴灑整個瓶消毒后放到超凈臺內(nèi)，嚴(yán)格無菌操作，培養(yǎng)箱靜置2-4小時。鏡下觀察：未超過80%匯合度時，可將瓶裝的完全培養(yǎng)液收集至離心管中，加入6ml完全培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)；超過80%匯合度時，根據(jù)情況傳代或者凍存，具體操作見細(xì)胞培養(yǎng)步驟。（注意發(fā)貨的是密封培養(yǎng)瓶的話，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)記得培養(yǎng)瓶蓋子擰松）
三、HPDE6-C7人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1）復(fù)蘇HPDE6-C7人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）HPDE6-C7人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
四、應(yīng)用
HPDE6-C7人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞可以用于MLCK在實驗性高甘油三脂血癥性胰腺炎胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中作用的初步研究：
高脂環(huán)境對胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞MLCK及細(xì)胞間緊密連接的影響目的:用油酸(oleic acid,OA)和軟脂酸(palmitic acid,PA)與HPDE6-C7細(xì)胞系|人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞共培養(yǎng),模擬體內(nèi)的高脂環(huán)境,觀察在高脂環(huán)境下HPDE6-C7細(xì)胞系|人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中MLCK,TJ相關(guān)蛋白和Ca2+通道m(xù)RNA的表達水平變化。
方法：分別用不同濃度的OA(100,200,300,400,500μM/L)和PA(100,200,300,400,500μM/L)處理HPDE6-C7細(xì)胞系|人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞24h。采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖;q PCR法檢測MLCK、ZO-1、Claudin-2、Occludin、Cav1.2、Cav1.3、Cav2.1、Cav2.2、Cav3.1、Cav3.2的mRNA表達水平。
結(jié)果：
1、(1)OA:在濃度為300μM,400μM和500μM時抑制HPDE6增殖,以500μM時抑制最明顯(P<0.05)。(2)PA:在濃度為200μM,300μM,400μM和500μM時抑制HPDE6增殖,以500μM時抑制最明顯(P<0.05)。
2、(1)OA:在濃度為400μM增加MLCK mRNA表達(P<0.05);濃度為300μM時抑制Occludin mRNA表達(P<0.05);不同濃度OA均抑制ZO-1 mRNA表達(P<0.05),且對Claudin-2 mRNA表達無影響(P>0.05)。(2)PA:增加MLCK mRNA表達,呈濃度依賴性(P<0.05);PA在濃度為200μM時抑制Claudin-2和Occludin mRNA表達(P<0.05);在濃度為100μM-300μM抑制ZO-1 mRNA表達(P<0.05)。
3、(1)OA:濃度在400μM和500μM時增加Cav2.2 mRNA表達(P<0.05);OA濃度在300μM,400μM和500μM時增加Cav1.2、Cav1.3、Cav2.1、Cav3.1mRNA表達(P<0.05);不同濃度OA對Cav3.2無影響(P>0.05)。(2)PA:濃度在200μM和500μM增加Cav1.2和Cav2.1 mRNA表達(P<0.05);PA濃度在300μM,400μM和500μM時增加Cav2.2和Cav3.2 mRNA表達(P<0.05);PA濃度在200μM,300μM,400μM和500μM時增加Cav1.3和Cav3.1mRNA表達(P<0.05)。
結(jié)論：
1、OA和PA抑制HPDE6-C7細(xì)胞系|人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞增殖,以500μM時抑制作用最明顯。
2、OA和PA上調(diào)HPDE6C7細(xì)胞中MLCK及Cav1.2、Cav1.3、Cav2.1、Cav2.2、Cav3.1 mRNA表達,減少ZO-1、Occludin和Claudin-2 mRNA表達。
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