小鼠睪丸間質(zhì)細胞的背景與應(yīng)用及培養(yǎng)操作步驟！
小楊 / 2024-01-02 09:39:52
一、背景
小鼠睪丸間質(zhì)細胞是睪丸中的一種支持細胞，位于生精小管之間。它們的主要功能是提供營養(yǎng)物質(zhì)和支持生殖細胞的發(fā)育和成熟。
小鼠睪丸間質(zhì)細胞在小鼠睪丸中占據(jù)了大約40%的體積，并通過其長長的突起與生精小管相連。它們通過分泌多種生長因子、激素和其他物質(zhì)來調(diào)節(jié)生精小管內(nèi)生殖細胞的發(fā)育和成熟。
維持生精小管的結(jié)構(gòu)：Sertoli細胞通過分泌膠原蛋白和其他基質(zhì)分子來維持生精小管的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。
支持精子的發(fā)育和成熟：Sertoli細胞通過分泌多種營養(yǎng)物質(zhì)和激素來支持精子的發(fā)育和成熟。
保護生殖細胞：Sertoli細胞可以分泌一些抗炎和抗氧化物質(zhì)來保護生殖細胞免受氧化應(yīng)激和其他有害因素的損傷。
1)復(fù)蘇小鼠睪丸間質(zhì)細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2)小鼠睪丸間質(zhì)細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)小鼠睪丸間質(zhì)細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。
b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
以鎘為受試物,選擇雄性小鼠、原代小鼠睪丸間質(zhì)細胞和睪丸間質(zhì)細胞系TM3細胞作為研究對象,探討鎘是否通過調(diào)控線粒體的融合與分裂以及線粒體自噬等途徑誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細胞凋亡,為全面了解鎘的男性生殖毒性機制提供新的證據(jù)。
鎘誘導(dǎo)雄性小鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡與自噬抑制的研究目的:在動物水平探討氯化鎘(Cadmium chloride,CdCl2)處理對小鼠睪丸間質(zhì)細胞毒性的潛在機制。
方法：根據(jù)隨機數(shù)值表將20只4周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分成四組,每組5只,分別以0、0.5、1.0和2.0 mg/kg/day濃度的CdCl2連續(xù)28天暴露,構(gòu)建染鎘動物模型。通過HE染色、精子計數(shù)和精子畸形率檢測評估鎘暴露后睪丸毒性。采用ELISA法、免疫組織化學(xué)法分別測定鎘暴露后血清睪酮含量以及小鼠睪丸間質(zhì)細胞數(shù)量。采用免疫熒光結(jié)合TUNEL染色分析小鼠睪丸中睪丸間質(zhì)細胞的凋亡情況。使用透射電子顯微鏡和免疫熒光分別觀察小鼠睪丸間質(zhì)細胞內(nèi)自噬體和LC3的變化。
結(jié)果：鎘暴露后,2.0 mg/kg鎘處理組小鼠體重從第二周開始下降(P<0.05),而0.5和1.0mg/kg鎘處理組中小鼠體重則從第三周開始下降(P<0.05),在4周暴露結(jié)束時,所有鎘處理組小鼠體重均較對照組下降。但睪丸/體重比值無顯著變化,精子數(shù)量降低且精子畸形率升高(P<0.05)。與對照組相比,鎘處理組小鼠的血清睪酮含量降低,生精小管結(jié)構(gòu)異常,精子細胞排列紊亂;睪丸間質(zhì)細胞數(shù)量減少且細胞凋亡率隨著染鎘劑量的升高而增加(P<0.05)。透射顯微鏡顯示,與對照組相比,鎘處理組小鼠睪丸間質(zhì)細胞內(nèi)有較多的自噬泡、自噬體并伴隨著極少量的自噬溶酶體形成。對睪丸組織的免疫熒光檢測顯示,鎘處理組自噬關(guān)鍵蛋白LC3在睪丸間質(zhì)細胞中表達,且隨著染鎘劑量的升高而表達增加。
結(jié)論：鎘暴露破壞了小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu),導(dǎo)致精子數(shù)量減少、精子畸形率增加、睪酮含量降低,產(chǎn)生生殖毒性。同時,鎘暴露誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細胞發(fā)生凋亡以及調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細胞內(nèi)的自噬水平。鎘誘導(dǎo)線粒體過度分裂致小鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡的機制目的:第一部分的研究結(jié)果表明,在動物水平鎘誘導(dǎo)了小鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡。以TM3細胞(小鼠睪丸間質(zhì)細胞的模式細胞系)為研究對象,通過觀察線粒體形態(tài)變化、線粒體分裂和融合蛋白表達、線粒體功能以及線粒體依賴性凋亡相關(guān)蛋白表達等指標,探討鎘暴露對TM3細胞凋亡的影響及可能的機制。
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