NCI-H1770人非小細胞肺癌貼壁細胞系的應用！
小楊 / 2024-01-29 10:48:59
一、背景
NCI-H1770人非小細胞肺癌貼壁細胞系的上皮樣細胞呈多角形，尺寸更為規(guī)則，貼附在基質上呈散在斑片狀生長。這種細胞系的培養(yǎng)實驗室的具體要求主要取決于開展的研究類型。例如，專業(yè)從事癌癥研究的哺乳動物細胞培養(yǎng)實驗室與從事蛋白質表達工作的昆蟲細胞培養(yǎng)實驗室等。
1)復蘇NCI-H1770人非小細胞肺癌貼壁細胞系細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產品說明書為主。
將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2)NCI-H1770人非小細胞肺癌貼壁細胞系細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)NCI-H1770人非小細胞肺癌貼壁細胞系細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數。
b、根據細胞數量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應用
闡明L1CAM(L1 cell adhesion molecule)對肺腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響,并揭示調控L1CAM功能的分子機制。
研究方案：
1、L1CAM與肺腺癌的臨床相關性研究收集經手術完整切除的,并有配對癌旁正常組織的88例肺腺癌標本,使用免疫組織化學技術檢測L1CAM的表達水平,并分析其表達量與患者預后的臨床相關性。
2、LICAM對肺腺癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響
(1)在肺腺癌細胞A549、NCI-H1299及NCI-H1770中,過表達或沉默L1CAM,通過Transwell、細胞增殖和細胞劃痕等實驗檢測L1CAM對肺腺癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響;
(2)采用轉座子系統(tǒng)構建sh L1CAM的小鼠原位肺癌模型,注射6周后處死小鼠,取肺組織標本計數腫瘤形成數量;
(3)在H460SM細胞過表達或沉默L1CAM,通過經支氣管肺內原位接種構建裸鼠氣管內原位腫瘤模型,達到預期終點后處死裸鼠,并比較實驗組與對照組腫瘤大小及轉移情況。
3、鑒定肺腺癌中上調L1CAM表達的通路及其對生物學功能的影響
(1)在NCI-H1770人非小細胞肺癌貼壁細胞系中通過si RNA干擾技術及Western blot檢測沉默PAK4、Slug后,L1CAM表達情況;
(2)在先前收集的肺癌患者手術標本中通過Western blot驗證PAK4、Slug的蛋白表達水平;
(3)通過生物信息學分析探索在抑制PAK4的mi RNA;
(4)通過RNAi技術在SPC-A-1,SPC-A-1sci轉染mi RNA或其抑制劑,采用q PCR,Western blot實驗檢測PAK4、Slug、L1CAM表達情況以及EMT相關蛋白(E-cadherin和Vimentin)的表達水平。
(5)采用Transwell及劃痕試驗驗證轉染后的SPC-A-1及SPC-A-1sci細胞侵襲和遷移能力。
(6)在裸鼠中尾靜脈注射轉染后的SPC-A-1sci或SPC-A-1細胞,7周后測量肺部轉移瘤數量,進一步驗證mi RNA通過PAK4/Slug/L1CAM途徑在肺腺癌中發(fā)揮的生物學功能。
研究結果：
1、在收集的肺腺癌組織標本中,癌組織L1CAM表達水平高于與其配對的癌旁組織;患者生存分析表明L1CAM高表達組較之于低表達者預后差(P<0.05)。
2、在A549,NCI-H1299,NCI-H1770人非小細胞肺癌貼壁細胞系中過表達L1CAM后,肺腺癌細胞侵襲和遷移能力較對照組明顯增強;沉默L1CAM,上述三組肺腺癌細胞的侵襲和遷移能力顯著降低,并可抑制小鼠腫瘤模型中原發(fā)性肺癌及轉移瘤的數量。然而細胞增殖實驗結果表明敲低或者過表達L1CAM后細胞增殖能力較對照組沒有顯著差異。
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