棒桿菌通用PCR試劑盒的知識(shí)與應(yīng)用及操作步驟！
小楊 / 2024-02-04 09:24:58
一、背景
棒桿菌通用PCR試劑盒是一種用于檢測棒桿菌屬細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)工具，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)進(jìn)行檢測。該試劑盒具有高靈敏度和特異性，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測出棒桿菌屬細(xì)菌，對于該細(xì)菌引起的感染疾病的診斷和治療具有重要意義。
棒桿菌通用PCR試劑盒的組成通常包括引物、Taq酶、dNTPs等必要的PCR反應(yīng)成分，以及可能包含的各種成分如染料、緩沖液、特異性結(jié)合探針等。引物是PCR反應(yīng)的關(guān)鍵成分，它們與棒桿菌屬細(xì)菌基因的特定區(qū)域結(jié)合，從而啟動(dòng)DNA的擴(kuò)增過程。Taq酶是一種耐熱的DNA聚合酶，能夠催化DNA的合成。dNTPs是合成DNA的基本原料。
使用棒桿菌通用PCR試劑盒進(jìn)行檢測時(shí)，首先需要采集感染棒桿菌屬細(xì)菌的患者的樣本，如血液、尿液或組織樣本。將樣本中的DNA或RNA與試劑盒中的引物和Taq酶等成分混合，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)過程中，DNA或RNA會(huì)不斷擴(kuò)增，最終形成大量的特定基因片段。通過凝膠電泳等技術(shù)對這些片段進(jìn)行分析，可以判斷出是否存在棒桿菌屬細(xì)菌基因，從而確定患者是否感染該細(xì)菌。
棒桿菌通用PCR試劑盒具有高靈敏度和特異性，能夠在極低濃度下檢測出棒桿菌屬細(xì)菌基因。此外，該試劑盒還具有快速、簡便、易于操作等特點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室檢測領(lǐng)域。然而，試劑盒也存在一定的局限性，如對實(shí)驗(yàn)條件和操作要求較高，可能出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果等問題，需要在使用時(shí)注意。
1、樣本采集：從患者體內(nèi)采集血液、糞便、組織等樣本，并將其保存在無菌容器中。
2、DNA提?。簩⒉杉降臉颖具M(jìn)行DNA提取，通常采用柱式或磁珠式DNA提取試劑盒。提取后的DNA應(yīng)保存在-20°C或更低的溫度下。
3、PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)備：根據(jù)棒桿菌通用PCR試劑盒的要求，配制PCR反應(yīng)體系，包括引物、熒光探針、dNTPs、DNA聚合酶等。
4、PCR反應(yīng)：將提取的DNA加入到PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件和時(shí)間根據(jù)試劑盒說明書的要求進(jìn)行設(shè)置。
5、結(jié)果分析：將PCR反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行熒光信號檢測，根據(jù)熒光信號的出現(xiàn)情況判斷是否存在棒桿菌的感染。
三、應(yīng)用
探討引起醫(yī)院感染的多重耐藥（Multi-drug resistant，MDR）紋帶棒狀桿菌的親緣性分析方法，并對其耐藥機(jī)理進(jìn)行初步研究。
方法：用棒桿菌通用PCR試劑盒的基因外重復(fù)回文序列擴(kuò)增（Repetitive ExtragenicPalindromic-PCR，REP-PCR）和腸細(xì)菌基因間共有重復(fù)序列擴(kuò)增（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR，ERIC-PCR）技術(shù)對重慶地區(qū)四家綜合型醫(yī)院分離到的紋帶棒狀桿菌進(jìn)行分型研究，用NTSYS PC2.1軟件對擴(kuò)增產(chǎn)物的指紋圖譜進(jìn)行聚類分析；用微量肉湯稀釋法對菌株進(jìn)行14種抗菌藥物（青霉素、頭孢吡肟、頭孢噻肟、亞胺培南、美羅培南、萬古霉素、慶大霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、克林霉素、利奈唑胺、復(fù)方新諾明、利福平）的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）檢測，根據(jù)耐藥表型，確定對耐藥基因核糖體甲基化酶基因(ermX)、核糖體保護(hù)蛋白基因（tet（W））、DNA螺旋酶A亞單位基因(gyrA)和接合型轉(zhuǎn)座子Tn1545整合酶基因（intTn）、L,D-轉(zhuǎn)肽酶基因(ldt1/2)進(jìn)行擴(kuò)增并測序分析，研究其與耐藥的相關(guān)性。
結(jié)果：棒桿菌通用PCR試劑盒的REP-PCR和改良ERIC-PCR分型技術(shù)分別將32株細(xì)菌分為6型和8型，所有菌株的相似系數(shù)（Coefficient）均大于0.73，兩種方法的分辨指數(shù)（DI）分別為0.585和0.696。
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