MHCC-97L人低轉(zhuǎn)移肝癌細胞的知識與應用！
小楊 / 2024-03-07 09:00:33
一、背景
MHCC-97L人低轉(zhuǎn)移肝癌細胞是一種人低轉(zhuǎn)移肝癌細胞系，來源于中山醫(yī)院。這種細胞系具有貼壁上皮樣的生長特性，生長速度較慢。其細胞形態(tài)為上皮細胞樣，細胞代數(shù)一般在10代以內(nèi)。
在細胞培養(yǎng)中，MHCC-97L細胞需要使用特定的培養(yǎng)基，通常是含有90%DMEM和10%FBS（胎牛血清）的培養(yǎng)基，同時還需要添加PS（青霉素-鏈霉素）以防止細菌感染。細胞傳代時，一般使用胰酶進行消化，傳代比例為1:2-1:4，具體取決于細胞生長速度和密度。
在使用MHCC-97L人低轉(zhuǎn)移肝癌細胞系時，需要注意細胞的培養(yǎng)條件、傳代方法和細胞保存等方面的問題，以確保細胞的生長狀態(tài)和實驗結(jié)果的準確性。此外，還需要遵守相關(guān)的實驗室安全規(guī)定和操作規(guī)程，以保證科研人員的人身安全和實驗室的正常運行。
1)復蘇MHCC-97L人低轉(zhuǎn)移肝癌細胞系：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2)MHCC-97L人低轉(zhuǎn)移肝癌細胞系傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)MHCC-97L人低轉(zhuǎn)移肝癌細胞系凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。
b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應用
探索慢病毒載體介導下STAT1基因在肝癌MHCC97L細胞中過表達和STAT1基因沉默后在MHCC97L細胞中表達量的變化及其分子生物學機制,從而探明STAT1基因是否為影響肝癌細胞生物學效應的靶向基因。
研究方法：
①根據(jù)人類STAT1基因的mRNA序列,全基因合成STAT1基因,構(gòu)建過表達載體,然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α細胞進行測序驗證。在脂質(zhì)體介導下轉(zhuǎn)染293T細胞,包裝產(chǎn)生慢病毒,再將慢病毒載體轉(zhuǎn)染至MHCC-97L人低轉(zhuǎn)移肝癌細胞系,熒光定量PCR及Westernblot檢測MHCC97L原始細胞株、MHCC97L-statl穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中STAT1的表達情況,確定STAT1過表達的有效性。
②設(shè)計shRNA干擾序列3對及對照序列1對,構(gòu)建3個shRNA干擾慢病毒載體,并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α行測序驗證。脂質(zhì)體介導下轉(zhuǎn)染293T細胞,包裝生產(chǎn)慢病毒,侵染MHCC-97L人低轉(zhuǎn)移肝癌細胞系,熒光定量PCR及Western blot檢測MHCC-97L人低轉(zhuǎn)移肝癌細胞系、MHCC97-statl過表達細胞株、MHCC97-shSTATl干擾細胞株中STAT1的表達情況,明確STAT1干擾的可行性。
研究結(jié)果：STAT1基因過表達研究結(jié)果：①STAT1基因合成：通過人類基因組數(shù)據(jù)庫STAT1mRNA序列,全基因合成STAT1基因(CDS區(qū)域序列)并基因測序驗證成功；②過表達慢病毒顆粒的包裝：脂質(zhì)體介導下轉(zhuǎn)染293T細胞成功,慢病毒侵染MHCC97L細胞,24h后熒光及可見光顯微鏡下觀察細胞,可見大部分細胞發(fā)出熒光,侵染成功；③PCR法檢測STAT1基因的表達：侵染48h后,相對于原始MHCC-97L人低轉(zhuǎn)移肝癌細胞系,穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株MHCC97-statl的STAT1基因表達量提高了10938倍,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),說明過表達慢病毒STAT1基因?qū)HCC-97L人低轉(zhuǎn)移肝癌細胞系的侵染率大于90%；④Western blot法檢測STAT1基因過表達：穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株MHCC97-statl的STAT1基因的蛋白條帶較原始MHCC97L細胞明顯增粗。
STAT1基因干擾沉默研究結(jié)果：①干擾慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定：shRNA干擾序列3對,另有對照序列1對連接入pLKO-1-EGFP-puro并基因測序驗證成功；②干擾慢病毒顆粒的包裝：脂質(zhì)體介導下轉(zhuǎn)染293T細胞成功,慢病毒侵染MHCC97L-STAT1細胞,24h后熒光及可見光顯微鏡下觀察細胞,可見大部分細胞發(fā)出熒光,侵染成功；③PCR法檢測STAT1基因的表達：侵染48h后,相對于原始MHCC-97L人低轉(zhuǎn)移肝癌細胞系,pLKO-1-statl-shRNA-1和pLKO-1-statl-shRNA-2的干擾效果比較好,各自的干擾效率為81.4%和72.1%,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明干擾慢病毒STAT1基因?qū)HCC-97L人低轉(zhuǎn)移肝癌細胞系干擾效果較好；④Western blot法檢測STAT1基因沉默后的表達：穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾細胞株MHCC97-shSTATl的STAT1基因的蛋白條帶較原始MHCC-97L人低轉(zhuǎn)移肝癌細胞系、過表達STAT1的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞明顯減少。
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