RIN-m5F細(xì)胞系的知識(shí)與應(yīng)用及培養(yǎng)操作！
小楊 / 2024-03-12 09:13:03
一、背景
RIN-m5F是一種來(lái)源于大鼠的胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞系。這些細(xì)胞是通過(guò)大劑量放射線照射近交系NEDH大鼠，再經(jīng)過(guò)裸鼠維持腫瘤后得到的。RIN-m5F細(xì)胞系具有分泌胰島素及L型多巴脫羧酶的特性，但不產(chǎn)生生長(zhǎng)激素抑制激素。因此，它們常被用于胰島細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和胰島腫瘤相關(guān)的研究。
在研究中，RIN-m5F細(xì)胞系常被用作體外模型來(lái)模擬胰島β細(xì)胞的功能和行為。例如，它們可以用于研究胰島素的分泌、合成和代謝等生物學(xué)過(guò)程，以及胰島β細(xì)胞在糖尿病等疾病中的變化。此外，RIN-m5F細(xì)胞系也可以用于藥物篩選和毒理學(xué)研究，以評(píng)估藥物對(duì)胰島β細(xì)胞的影響和潛在毒性。
然而，需要注意的是，雖然RIN-m5F細(xì)胞系具有一定的代表性，但并不能完全模擬真實(shí)的人體環(huán)境。因此，在將實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用于臨床之前，仍需要進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和臨床研究。
此外，有研究表明，金絲桃素的光動(dòng)力學(xué)效應(yīng)可以顯著地抑制RIN-m5F細(xì)胞的增殖，這為開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了思路。同時(shí)，RIN-m5F細(xì)胞系也被用于軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)，以研究化合物對(duì)細(xì)胞活力的影響。
1)復(fù)蘇RIN-m5F細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)RIN-m5F細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)RIN-m5F細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
RIN-m5F可以用于γ-氨基丁酸對(duì)RIN-m5f細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制探究：
研究擬建立高糖（G）和H2O2氧化損傷RIN-m5f細(xì)胞模型，以探討GABA對(duì)胰島β細(xì)胞抗氧化調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)制。
方法：分別采用11mM、22mM、44mM G孵育RIN-m5f細(xì)胞48h，以及10μM、50μM、100μM H2O2孵育1h建立體外氧化損傷細(xì)胞模型。GABA干預(yù)實(shí)驗(yàn)分為：對(duì)照組（11mM G）、損傷組（G/H2O2）、GABA組（G/H2O2+GABA）、硫辛酸組（G/H2O2+LA）。采用DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平；檢測(cè)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)指標(biāo)和胰島素分泌水平；MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡線粒體膜電位；RT-PCR法檢測(cè)與抗氧化、抗凋亡和胰島素分泌相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平；Western blot法檢測(cè)Nrf2和GSK-3β蛋白水平、p-GSK-3β（Ser9）和p-GSK-3β（Tyr216）磷酸化水平。
結(jié)果：隨著G和H2O2濃度的增加，胞內(nèi)ROS和MDA水平顯著提高（P<0.05），且GAD1mRNA表達(dá)水平極顯著下調(diào)（P<0.01），細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的氧化損傷（P<0.05）；添加100μM和200μM GABA可顯著降低胞內(nèi)ROS和MDA水平（P<0.05），提高T-AOC、GSH-Px、CAT、SOD活力，上調(diào)抗氧化及抗凋亡相關(guān)基因Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2mRNA表達(dá)水平（P<0.05），提高細(xì)胞線粒體膜電位和存活率（P<0.05）；此外，GABA可顯著提高胰島素合成相關(guān)基因（INS-2、Pdx-1、MafA、GK、GLUT2、Gabra2）mRNA表達(dá)水平（P<0.05），促進(jìn)胰島素分泌釋放；Western blot結(jié)果顯示，GABA顯著抑制氧化損傷細(xì)胞（44mM G和100μM H2O2）GSK-3β蛋白水平（P<0.05），顯著提高p-GSK-3β（Ser9）磷酸化水平和Nrf2核質(zhì)比例（P<0.05），但對(duì)p-GSK-3β（Tyr216）磷酸化水平無(wú)顯著性影響（P>0.05）。
結(jié)論：GABA可顯著增強(qiáng)氧化損傷（G和H2O2）RIN-m5f細(xì)胞抗氧化能力，提高細(xì)胞存活率和胰島素合成分泌，具有抗凋亡作用；GABA可調(diào)節(jié)胞內(nèi)GSK-3β/Nrf2通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平，顯著提高Nrf2核質(zhì)比例，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，其作用機(jī)制可能與提高p-GSK-3β(Ser9)磷酸化水平、降低GSK-3β蛋白水平有關(guān)；GABA抗氧化調(diào)節(jié)作用具有濃度依賴(lài)效應(yīng)，即隨著氧化損傷程度的增加，GABA需要量增加。
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