人胚肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)操作步驟及應(yīng)用研究！
小楊 / 2024-03-21 09:08:44
一、背景
人胚肺成纖維細(xì)胞是由H·Kuramoto于1968年分離的HEC-1-A細(xì)胞亞株。不同于HEC-A-1的是：HEC-1-B細(xì)胞在培養(yǎng)第13Chemicalbook5天到190天之間表現(xiàn)出穩(wěn)定的生長周期，且重現(xiàn)扁平，與親本細(xì)胞系相比更具鋪路石樣。此外，HEC-1-B細(xì)胞的主要染色體組是親本細(xì)胞的兩倍。
人胚肺成纖維細(xì)胞來自14周齡男性胎兒的正常肺組織，為有限細(xì)胞系該細(xì)胞，老化前能傳代42到46次群體倍增。它是正常二倍體細(xì)胞系，46，XY核型。模式染色體數(shù)為46，概率為70%。
1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備MEM培養(yǎng)基；北美胎牛血清，10%；PS 1%。
2）人胚肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）人胚肺成纖維細(xì)胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。
2、人胚肺成纖維細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇人胚肺成纖維細(xì)胞：將含有1mL人胚肺成纖維細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查人胚肺成纖維細(xì)胞密度。
2）人胚肺成纖維細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
3）人胚肺成纖維細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗人胚肺成纖維細(xì)胞1-2次。
2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2ml完全培養(yǎng)基終止消化。
3、按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。
4、將人胚肺成纖維細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
下面以T25瓶為例；
1、人胚肺成纖維細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入2ml完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2、1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮人胚肺成纖維細(xì)胞，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識。
3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
探討P物質(zhì)(Substance P,SP)對人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)增殖與活化的作用及其調(diào)控機(jī)制,進(jìn)一步揭示P物質(zhì)參與肺間質(zhì)纖維化中的作用機(jī)理,為臨床治療肺間質(zhì)纖維化的藥物研究與開發(fā)提供新的思路。
方法：
體外培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5),取對數(shù)生長期的細(xì)胞為研究對象,展開以下研究:
(1)以系列濃度(1、10、100、1000、10000 n M)的P物質(zhì)處理MRC-5細(xì)胞,利用CCK8法檢測系列濃度的P物質(zhì)在不同時間點(diǎn)(24、48、72h)對MRC-5增殖活性影響。從而篩選出P物質(zhì)對MRC-5細(xì)胞的作用濃度及時間。
(2)利用天狼猩紅染色檢測系列濃度的P物質(zhì)在72h時MRC-5細(xì)胞分泌膠原纖維含量變化。
(3)使用Western blot檢測系列濃度的P物質(zhì)在72h時MRC-5細(xì)胞對α-SMA蛋白表達(dá)的影響。
(4)在此基礎(chǔ)上,我們將細(xì)胞分為三個組,分別是對照組、100 n M P物質(zhì)組(簡稱P物質(zhì)組)、100 n M P物質(zhì)+10μM L732138組(NK-1R抑制劑)(以下簡稱P物質(zhì)+L732138組),將以上三組細(xì)胞培養(yǎng)72h后,分別以CCK8法檢測各組細(xì)胞增殖活性,用天狼猩紅染色檢測各組細(xì)胞分泌膠原纖維的含量變化,利用Western blot檢測各組細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)的變化,從而闡明P物質(zhì)對MRC-5細(xì)胞的增殖及活化作用。
(5)為研究P物質(zhì)對MRC-5細(xì)胞的作用機(jī)制,將對照組、P物質(zhì)組、P物質(zhì)+L732138組三組細(xì)胞體外培養(yǎng)72h,利用Western blot檢測各組細(xì)胞TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白的表達(dá)變化。
(6)為進(jìn)一步檢測SP/NK-1R在TGF-β1/Smad3信號通路中的作用,我們再次將細(xì)胞分為三個組,分別是對照組、100 n M P物質(zhì)組(簡稱P物質(zhì)組),100 n M P物質(zhì)+10μM SB431542組(TGFβR1抑制劑)(以下簡稱P物質(zhì)+SB431542組),分別以CCK8法檢測各組細(xì)胞增殖活性,用天狼猩紅染色檢測各組細(xì)胞分泌膠原纖維的含量變化。
結(jié)果：
(1)MRC-5細(xì)胞經(jīng)系列濃度(1、10、100、1000、10000 n M)P物質(zhì)處理后,24 h后OD值無明顯變化;與對照組比較,在處理48h及72h后,100n M P物質(zhì)組細(xì)胞OD值均升高,其中以72h時OD值升高更為明顯(P<0.01)。
(2)MRC-5細(xì)胞經(jīng)系列濃度P物質(zhì)處理72 h后,與對照組比較,100 n M P物質(zhì)組處理的細(xì)胞膠原纖維含量明顯增多(P<0.001)。
(3)經(jīng)系列濃度P物質(zhì)處理72 h后,與對照組比較,10 n M P物質(zhì)組及100 n M P物質(zhì)組細(xì)胞α-SMA蛋白相對表達(dá)水平均增高,其中以100 n M P物質(zhì)組增高更為顯著(P<0.001)。
(4)細(xì)胞經(jīng)藥物處理72h后,與P物質(zhì)組比較,P物質(zhì)+L732138組細(xì)胞膠原纖維含量顯著減少(P<0.001)、細(xì)胞OD值及α-SMA蛋白相對表達(dá)量均明顯降低(P<0.01)。
(5)細(xì)胞經(jīng)藥物處理72h后,與P物質(zhì)組比較,P物質(zhì)+L732138組細(xì)胞TGFβ1、p-Smad3蛋白相對表達(dá)量均明顯降低(P<0.01)。
(6)細(xì)胞經(jīng)藥物處理72h后,與P物質(zhì)組比較,P物質(zhì)+SB431542組細(xì)胞OD值、膠原纖維含量均明顯降低(P<0.001)。
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