食品中金黃葡萄球菌的檢測方法及操作步驟！
小楊 / 2024-04-10 09:16:29
金黃色葡萄球菌是一種引起人類和動物化膿感染的重要致病菌，也是造成人類食物中毒的常見致病菌之一。這種菌廣泛分布于自然界，如空氣、土壤、水及其它環(huán)境中。在人類和動物的皮膚及外界相通的腔道中，也經(jīng)常有本菌存在。據(jù)報導，在正常人群中的帶菌率可達30%~80%，其中皮膚帶菌率為8~22%，鼻腔和咽喉部等上呼吸道的帶菌率在40~50%以上，因此其可通過各種途徑和方式，尤其是經(jīng)工作人員的手和上呼吸道而污染食品。由于致病金黃葡萄球菌能產(chǎn)生腸毒素，故一旦細菌污染食品，并在合適的溫度環(huán)境下，細菌可以大量繁殖并產(chǎn)生腸毒素，從而引起消費者食物中毒。
由
金黃色葡萄球菌引起的食物中毒，在世界各國都極為普遍。特別是在北美及歐洲等地區(qū)的發(fā)病率更高。在上述這些國家中，每年有金黃色葡萄球菌引起的食物中毒病例，僅次于沙門氏菌，而在細菌性食物中毒病例排到第2~3位，因此而造成的經(jīng)濟損失也相當慘重，在我國由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒病例也時有報導，所以目前世界各國都把金黃色葡萄球菌列為食品衛(wèi)生的法定檢測項目。
目前我國對
金黃色葡萄球菌目前采用的方法是以國家標準GB.4789-10-84及檢驗檢疫系統(tǒng)行業(yè)標準SN.0172-92作為依據(jù)。整個檢測過程獲得最終結果須時5天左右，既費時又費力，并造成貨物積壓，也影響貨物的及時出運，并使貨主的倉儲成本提高，造成較大的經(jīng)濟損失。
多年來很多食品微生物實驗室都在探索和尋找一些準確性高，并快速的檢測方法，最近我們分別從美國3M公司和法國生物梅里埃公司獲得兩種快速檢測致病性
金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基，其名稱為：
①Petrifilm RSA. Count Plate（由美國3M公司研制生產(chǎn)），是一種薄膜型快速檢測金黃色葡萄球菌的計數(shù)平板。
②Baird-parker + RPF Agar.（由法國生物梅里埃公司研制生產(chǎn)的用Baird-Parker瓊脂加免血漿纖維蛋白原的金黃色葡萄球菌檢測計數(shù)平板）。
原理：Petrifilm. RSA. 測試薄膜是由二部分組成。第一部分是由黃金色葡萄球菌培養(yǎng)基片，此培養(yǎng)基中含有經(jīng)修正的Barid-Parker，營養(yǎng)成分加上以冷水可溶解的膠質。第二部分是一種耐熱核酸酶（TNase）反應片，含有DNA及甲苯胺蘭 ( Toluidine Blue - O )及四唑指示劑 (Tetraeolium)。此指示劑有助于菌落的計數(shù)及確定葡萄球菌耐熱核酸酶的存在。
耐熱去氧核糖核酸（deoxyribonulcas Dnase）為產(chǎn)毒金葡菌之典型特征，此酶非常耐熱，在100℃加熱30min，不易喪失活性，在130℃之下，其D值為16.6min，此酶之分子量為16800，等電點PH為9.6,耐熱去氧核糖酸與檢測血漿凝固酶相似，是一種鑒定金黃色葡萄球菌的方法，在Petrifilm. RSA 檢測片上，耐熱DNA酶反應看起來，呈粉紅色環(huán)帶包圍著一個紅色或蘭色的菌落。
Petrifilm.RSA檢測片，必須與Peyrifilm耐熱核酸酶反應片一起使用，單獨使用將不會顯示菌落，因為具有輔助計數(shù)菌落的指示劑是在反應片上，而不是在Petrifilm.RSA檢測片上。
Baird-parker + RPF agar，這一培養(yǎng)基中含有豐富的營養(yǎng)成分，其中以氯化鋰代替亞碲酸鉀，使菌落顏色呈黑色，RPF補充有兔血漿和牛纖維蛋白原，以便檢測凝固酶活力，胰酶可以抑制全部或部分圍繞凝固酶陽性菌落周圍沉淀暈環(huán)纖維蛋白的溶解，因此凡存在血漿凝固酶陽性的
金黃色葡萄球菌，將在培養(yǎng)基中呈現(xiàn)有暈環(huán)的黑色菌落，即可確認，并作計數(shù)。
實驗操作步驟
材料和方法：
本次實驗采用以下3種試劑：
1.美國3M公司提供的Petrifilm. Rapid. S. aureus Count Plate.
2.法國生物~梅里埃公司提供的Baird-Parker + RPF agar 。
3.實驗室自配Baird-Park瓊脂（英國Oxoid）及新鮮兔血漿。
菌種來自美國菌種保存中心（America TyP Culture Collection）。
金黃色葡萄球菌共10株菌株，其菌號分別為：
ATCC 27661 ATCC 27664 ATCC 13565 ATCC 51704
ATCC(K) 12600 ATCC(R) 65389 ATCC 25923 ATCC 29213
ATCC 8095 ATCC 12598
非金黃色葡萄球菌菌種5株，其菌號分別為：
本次實驗是以同一測試樣品經(jīng)均質并通過無菌生理鹽水作10倍遞增稀釋后取1至2個稀釋度同時接種上述三種培養(yǎng)基作平行實驗，在取得最終結果后相互進行比對。
上述三種培養(yǎng)基的接種方法是按生產(chǎn)商所提供的使用說明進行操作，另外Baird-Parker Agar 培養(yǎng)基是按SN0172-92標準進行操作。
A、本次實驗共測試已知標準菌種共15株，其中葡萄球菌10株，其他菌種5株（包括大腸桿菌、陰溝腸桿菌、腸炎沙門氏菌、枯草桿菌和無乳鏈球菌）。
B、測試自然食品檢樣共101只（其中包括肉11只、肉類14只、水產(chǎn)品17只、牛奶25只、蔬菜22只、豆制品12只）。
結果：
A、被檢菌種10株，金黃色葡萄球菌在三種培養(yǎng)基上都能檢出生長情況良好，同一稀釋度的菌液，除個別菌株外在3種培養(yǎng)基計數(shù)檢測結果基本都在一個數(shù)量級上，無顯著差異。而5株非金黃色葡萄球菌的菌株在三種培養(yǎng)基上全部不能生長。
B、自然食品檢樣共接種101只，每一檢樣同一稀釋濃度分別同時種三種培養(yǎng)基，最終共檢出金黃色葡萄球菌45只，占全部檢樣的44.5％，其中Petrifilm RSA 檢出陽性結果為42只，占全部陽性檢樣的93.3％，Baird-Parker＋RPF Agar. 檢出陽性結果26只，占全部陽性檢樣的57.7％。Baird-Parker. Agar 檢出陽性結果32只，占全部陽性檢樣的71.1％。
討論
1.用15株標準菌在3種培養(yǎng)基中的檢測，10株
金黃色葡萄球菌以同一濃度接種，結果生長良好，其最終計數(shù)基本一致，定位在同一數(shù)量級，5株非金黃色葡萄球菌接種上述三種培養(yǎng)基全部不長，說明上述三種培養(yǎng)基對金黃色葡萄球菌選擇良好。
2.以101只自然樣品同一均質稀釋液，同時接種三種培養(yǎng)基，從最終結果來看，對金黃色葡萄球菌的陽性檢出率為44.5％。
3.從檢測程序來年，Petrifilm. RSA及Baird-Parker＋RPF. Agar. 都在樣品接種后28~30h觀察結果，并不必再做證實試驗，而如以Baird-Parker Agar檢測，須在接種后48h觀察平板，并挑取可疑菌落轉種到營養(yǎng)肉湯中，在經(jīng)18-24h后做血漿凝固酶或耐熱DNA酶試驗進行證實，最終計數(shù)，前后約須80h。
4.從本次試驗中觀察，使用上述三種培養(yǎng)基對食品中金黃色葡萄球菌含量的直接計數(shù)檢測，其樣品接種液的含量擬控制在100個/ml以內，比較容易分清并計數(shù)，如菌量過濃，則將會影響最后的讀數(shù)，因此對新送的被檢樣品，如在不了解污染的情況下一般必須要做2個以上的稀釋度，同時分別接種，才能獲得較為滿意的結果。
而在Baird-Parker＋RPF Agar及Baird-Parker. Agar接種時必須將1ml樣液作三只平板涂布（0.3、0.3、0.4ml）這樣就會造成手續(xù)繁瑣試劑消耗較大，但Baird-Parker. RPF. 培養(yǎng)基也可以1ml樣液作傾注培養(yǎng)，并作計數(shù)。
5.在整個測試過程中，我們發(fā)現(xiàn)，按使用說明對Petrifilm. RSA. 及Barid-Parker＋RPF. Agar，操作規(guī)定在接種24h后觀察結果，此時往往由于菌落長得經(jīng)較小，特征瓜不明顯，但如果繼續(xù)放置一夜以后金葡萄菌落特征明顯，并可能會經(jīng)第一天觀察數(shù)量有所增加，這樣可以提高檢測結果的可信度。
6.由于對上述兩種培養(yǎng)基的試用期間我們尚未獲得供應商的報價，故無法測算每一樣品的測試成本價格。但可以予計上述兩面種快速檢測培養(yǎng)基的耗材費用要高于常規(guī)經(jīng)典方法（Baird-Parker Agar）的費用。
7.通過本次實驗，我們感到使用美國3M公司生產(chǎn)的Petrifilm. RSA Plate培養(yǎng)基和法國生物－梅利埃公司生產(chǎn)的Baird-Parker RPF. Agar培養(yǎng)基檢測中的金黃色葡萄球菌?？梢员饶壳俺Ｒ?guī)檢測方法時間可縮短一半。并可以明顯節(jié)省大量人力。這完全符合實驗室快速檢測的要求，尤其是對基層較簡陋的實驗室條件中，更顯其使用方便的優(yōu)越性。
可以通過本次試驗了解一下步驟，培養(yǎng)基可以選用青島海博生物技術有限公司的，效果相當不錯。
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