大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的應(yīng)用及培養(yǎng)操作步驟！
小楊 / 2024-04-25 10:10:43
一、背景
大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞指的是大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。子宮內(nèi)膜是指構(gòu)成哺乳類子宮內(nèi)壁的一層，對動情素和孕激素都起反應(yīng)，因此可隨著性周期（發(fā)情周期、月經(jīng)周期）發(fā)生顯著的變化。子宮內(nèi)膜覆蓋著粘膜，由粘膜上皮與其下方的固有層所組成，而粘膜上皮為柱狀上皮、立方上皮或復(fù)層柱狀上皮。當(dāng)動情素分泌時(shí)，各上皮細(xì)胞將長大、分裂使數(shù)目增多。
大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞具有一些特性，包括組織來源于實(shí)驗(yàn)動物的正常子宮組織，細(xì)胞鑒定顯示廣譜角蛋白（PCK）免疫熒光染色為陽性，經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高于90%，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌。在培養(yǎng)條件下，這些細(xì)胞以鋪路石狀、不規(guī)則形態(tài)貼壁生長。
1)復(fù)蘇大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
探討益氣化瘀方對子宮復(fù)舊不全大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax表達(dá)的影響,了解產(chǎn)后子宮內(nèi)膜發(fā)生、增殖和演變的規(guī)律,為多種產(chǎn)后疾病的預(yù)防和治療提供重要的指導(dǎo)依據(jù)。
方法：分娩后40只SD大鼠隨機(jī)分為五組,每組別含有8只SD雌鼠,分別是：空白組、模型組、新生化顆粒組、益氣化瘀方低劑量組、益氣化瘀方高劑量組。分娩后,將過夜培養(yǎng)(生理鹽水稀釋成1.0×107個(gè)/mL)的大腸桿菌,分別對模型組、新生化顆粒組、益氣化瘀方高、低劑量組進(jìn)行造模,即子宮內(nèi)接種大腸桿菌,子宮接種量為0.2mL。于造模成功后第一天,分別給予空白組、模型組、新生化顆粒組、益氣化瘀方高、低劑量組連續(xù)7天灌胃處理,第8天腹主動脈采血后,取標(biāo)本。通過光鏡觀察HE染色各組大鼠子宮切片的病理改變；采用TUNEL法檢測Rat Endometrial Epithelial Cells細(xì)胞凋亡及免疫組化Bcl-2蛋白、Bax蛋白的表達(dá)。
結(jié)果：
(1)光鏡下觀察,模型組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞連續(xù)性部分中斷,且子宮內(nèi)膜部分小血管擴(kuò)張、充血,上皮細(xì)胞壞死脫落,間質(zhì)疏松水腫,大量的炎性細(xì)胞浸潤；新生化組及益氣化瘀方高劑量組子宮內(nèi)膜連續(xù)性好,無明顯的上皮損傷,未見明顯炎細(xì)胞浸潤,間質(zhì)致密；益氣化瘀低劑量組大鼠子宮內(nèi)膜可見少量連續(xù)性中斷,內(nèi)膜上皮損傷較輕,間質(zhì)較致密,炎細(xì)胞少。
(2)與空白組比較,模型組的大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)；與模型組比較,益氣化瘀方高、低劑量及新生化組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率普遍降低(P<0.01)；與新生化組比較,益氣化瘀方低劑量組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率高(P<0.01),益氣化瘀方高劑量子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
(3)與空白組比較,模型組Bcl-2表達(dá)明顯減少(P<0.01),Bax表達(dá)增多(P<0.01)；給藥后,與模型組比較,益氣化瘀方低、高劑量及新生化組Bcl-2表達(dá)增多(P<0.01),Bax表達(dá)少(P<0.01)；與新生化組比較,益氣化瘀方低劑量組Bcl-2表達(dá)減少(P<0.01),Bax表達(dá)增多(P<0.01),益氣化瘀方高劑量組Bcl-2表達(dá)減少,Bax表達(dá)增多,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
結(jié)論：益氣化瘀方可能通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)及下調(diào)Bax蛋白的表達(dá),降低大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生,促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生修復(fù),從而促進(jìn)產(chǎn)后子宮復(fù)舊。
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