別樣惡臭假單胞菌的培養(yǎng)方法與實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及操作步驟！
小楊 / 2024-04-26 09:54:56
別樣惡臭假單胞菌，革蘭陰性桿菌，有些菌株為卵圓形，單端叢毛菌，運(yùn)動(dòng)活潑。專性需氧，最適生長(zhǎng)溫度25℃~30℃，42℃不生長(zhǎng)，4℃生長(zhǎng)不定，菌落與銅綠假單胞菌相似，但只產(chǎn)生熒光素（青膿素），不產(chǎn)生綠膿素，借此可與銅綠假單胞菌相區(qū)別，其陳舊培養(yǎng)物有腥臭味。
一、菌種簡(jiǎn)介
規(guī)格：凍干粉
拉丁屬名：Pseudomonas Alloputida
培養(yǎng)基：蛋白胨：10.0，牛肉粉：3.0，氯化鈉：5.0，瓊脂：15.0，pH值：7.3±0.1(25℃)
生長(zhǎng)條件：30℃；18-24h；好氧
存儲(chǔ)條件：2-8℃
安全等級(jí)：2
形態(tài)：菌落直徑為1-2mm，圓形，邊緣整齊，不透明，正面黃色，顏色較淺，中間凸起，表面光滑，質(zhì)地濕潤(rùn)，G－（紅），桿菌。
分離基物：土壤
模式菌株：no
應(yīng)用領(lǐng)域：生物信息學(xué)
用途：研究
注意事項(xiàng)：僅用于科學(xué)研究或者工業(yè)應(yīng)用等非醫(yī)療目的不可用于人類或動(dòng)物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產(chǎn)品信息以出庫(kù)為準(zhǔn)）
二、培養(yǎng)基
* 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）
* 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）
* LB 培養(yǎng)基（以上三款培養(yǎng)基任選一種即可）
三、培養(yǎng)方法
1、菌種是指食用菌菌絲體及其生長(zhǎng)基質(zhì)組成的繁殖材料。菌種分為母種（一級(jí)種）、原種（二級(jí)種）和栽培種（三級(jí)種）三級(jí)。工業(yè)發(fā)酵的有用菌種，其篩選步驟包括菌種分離、初篩和復(fù)篩。
2、挑選具有某種能力的有用菌種，也稱種子制備，是指菌種在一定條件下，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)成為具有一定數(shù)量和質(zhì)量的純生產(chǎn)菌種的制備過程。以作接入發(fā)酵罐中進(jìn)一步擴(kuò)大菌體量及合成產(chǎn)物之用。
3、種子制備包括孢子制備和菌絲體制備菌種制備。
4、保存在沙土管或冷凍管中的生產(chǎn)菌種，用無菌手續(xù)挑取少許，接入瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在25℃（或較高溫度）下培養(yǎng)5～7天（或較長(zhǎng)時(shí)間。所得孢子還需進(jìn)一步用較大表面積的固體培養(yǎng)基以獲得更多孢子（對(duì)于霉菌類孢子制備，多數(shù)采用大米、小米之類的天然培養(yǎng)基）。
5、將培養(yǎng)成熟的斜面孢子制成懸浮液，接種到扁瓶固體培養(yǎng)基上，于25～28℃培養(yǎng)14天。將成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入 4℃冰箱中備用。一次制得的孢子瓶可在生產(chǎn)上延續(xù)使用半年左右。
6、如果有些生產(chǎn)菌種不產(chǎn)孢子，如赤霉素產(chǎn)生菌或產(chǎn)孢子不多的，則可采用搖瓶液體培養(yǎng)制得菌絲體，作種子罐的種子。種子罐的目的是使接入有限的孢子或菌絲體迅速發(fā)芽、生長(zhǎng)、繁殖成大量菌體。其中的培養(yǎng)基組分應(yīng)是易于被菌體利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米漿），及無機(jī)鹽(如磷酸鹽)等。作為發(fā)酵罐的種子應(yīng)生命力旺盛、染色深、菌絲粗壯，無雜菌及異常菌體。接種量一般在10%～20%。
四、操作步驟
①準(zhǔn)備1支含有5~10mL液體培養(yǎng)基或無菌水的試管和2個(gè)平板；
②安全柜中打開，用酒精燈灼燒頂部，后迅速滴上無菌水使之破裂，隨后用鑷子將其敲碎；
③吸取0.5mL液體培養(yǎng)基打入凍干管，充分溶解后重新打回液體試管中，混勻；
④吸取0.2mL菌懸液打入平板中，涂布均勻，重復(fù)兩次獲得兩個(gè)平板；
⑤置于上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，菌種長(zhǎng)出即可使用。
五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、稱量→溶化→調(diào)pH→過濾→分裝→加塞→包扎→滅菌→無菌檢查
2、干熱滅菌:裝入待滅菌物品→升溫→恒溫→降溫→開箱取物
3、高壓蒸汽滅菌:加水→裝物品→加蓋→加熱→排冷空氣→加壓→恒壓→降壓回零→排汽→取物→無菌檢查
4、過濾除菌:組裝滅菌→連接→壓濾→無菌檢查→清洗滅菌
六、注意事項(xiàng)
1）凍干粉首次活化，干粉要全部用完，不能預(yù)留，用無菌吸管吸取 0.3ml 的培養(yǎng)液（即以上建議的培養(yǎng)基配方，不加瓊脂）或者無菌水，滴入凍干管中，輕輕振蕩至其溶解。吸取全部菌懸液，接種在培養(yǎng)基上（建議不超過 2 支平板或者斜面，若接種液體培養(yǎng)基，則試管液體不超過 5ml 為宜）；
2）經(jīng)過冷凍干燥保藏，菌種處于休眠狀態(tài)，復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)可能會(huì)延遲生長(zhǎng)，這時(shí)需較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間； 若您收到的是已復(fù)蘇的培養(yǎng)物（非凍干菌），則可以直接用于您的實(shí)驗(yàn)，或根據(jù)需要轉(zhuǎn)接培養(yǎng)如有不明白之處，請(qǐng)務(wù)必先咨詢我單位技術(shù)人員，避免不必要的損失；
3）微生物菌種應(yīng)保藏于低溫、清潔干燥的地方，室溫放置時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致菌種衰退；
4）菌種操作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行；轉(zhuǎn)種完畢，應(yīng)經(jīng)滅菌再做丟棄處理；
5）應(yīng)根據(jù)菌種狀況及時(shí)轉(zhuǎn)接，凍干菌種保藏時(shí)間通常為 2-25 年；
6）菌種使用過程中如出現(xiàn)雜菌污染或菌種生產(chǎn)性能下降或不活，請(qǐng)?jiān)谑盏胶?2 個(gè)月內(nèi)和
微生物菌種查詢網(wǎng)聯(lián)系，逾期不予受理；
7）打管操作需由專業(yè)微生物技術(shù)人員在相應(yīng)的防護(hù)設(shè)備中進(jìn)行，生物危害程度為三類的菌種應(yīng)在生物安全柜中操作，打管時(shí)凍干管應(yīng)遠(yuǎn)離面部，保護(hù)眼睛。
8）安瓿瓶開封：用浸過 75％酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，用火焰加熱其頂端，滴少量（2-3滴）無菌水至加熱頂端使之破裂，用銼刀或者鑷子敲下已破裂的安瓿管頂端并將凍干管開口處在火焰上過一遍，并保持在火焰旁操作。
9）甘油管使用：使用本甘油菌時(shí)可以不用完全融解，在甘油菌表面蘸取少量涂板或進(jìn)行液體培養(yǎng)即可。也可以完全融解后使用，但隨著凍融次數(shù)的增加，細(xì)菌的活力會(huì)逐漸下降。
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