微生物平板菌落計數(shù)法之標準步驟與具體操作方法！
小楊 / 2024-08-24 09:00:52
微生物平板菌落計數(shù)法之標準步驟與具體操作方法有哪些？快來看一看吧！
操作方法一：
1、以無菌操作取檢樣25g（或25ml)，放于225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內（瓶內預置適當數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內，經充分振搖或研磨制成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質器中以8000~10000r/min的速度處理1min，制成1：10的均勻稀釋液。用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內，振搖試管混合均勻，制成1：100的稀釋液。另取1ml滅菌吸管，按上項操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管。
2、無菌操作：操作中必須有“無菌操作”的概念，所用玻璃器皿必須是完全滅菌的，不得殘留有細菌或抑菌物質。所用剪刀、鑷子等器具也必須進行消毒處理。樣品如果有包裝，應用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。操作應當在超凈工作臺或經過消毒處理的無菌室進行。瓊脂平板在工作臺暴露15分鐘，每個平板不得超過15個菌落。
3、采樣的代表性：如系固體樣品，取樣時不應集中一點，宜多采幾個部位。固體樣品必須經過均質或研磨，液體樣品須經過振搖，以獲得均勻稀釋液。
4、樣品稀釋誤差：為減少樣品稀釋誤差，在連續(xù)遞次稀釋時，每一稀釋液應充分振搖，使其均勻，同時每一稀釋度應更換一支吸管。在進行連續(xù)稀釋時，應將吸管內液體沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀釋液內，以免吸管外部粘附的檢液溶于其內。為減少稀釋誤差，SN標準采用取10mL稀釋液，注入90mL緩沖液中。
5、稀釋液：樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水，有的采用磷酸鹽緩沖液（或0.1%蛋白胨水），后者對食品中已受損傷的細菌細胞有一定的保護作用。如對含鹽量較高的食品（如醬油）進行稀釋，可以采用滅菌蒸餾水。
操作方法二：
1、根據(jù)標準要求或對污染情況的估計，選擇2~3個適宜稀釋度，分別在制10倍遞增稀釋的同時，以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中，每個稀釋度做兩個平皿。將涼至46℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15ml，并轉動平皿，混合均勻。同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內作空白對照。待瓊脂凝固后，翻轉平板，置36±1℃溫箱內培養(yǎng)48±2h，取出計算平板內菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數(shù)。
2、傾注用培養(yǎng)基應在46℃水浴內保溫，溫度過高會影響細菌生長，過低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無水浴，應以皮膚感受較熱而不燙為宜。傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從12~20ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時，培基底部如有沉淀物，應將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計數(shù)觀察。
3、為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉混勻，可正反兩個方向旋轉，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min，以防止細菌有所死亡或繁殖。
4、培養(yǎng)溫度一般為37℃（水產品的培養(yǎng)溫度，由于其生活環(huán)境水溫較低，故多采用30℃）。培養(yǎng)時間一般為48h，有些方法只要求24h的培養(yǎng)即可計數(shù)。培養(yǎng)箱應保持一定的濕度，瓊脂平板培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)基失重不應超過15%。
5、為了避免食品中的微小顆粒或培基中的雜質與細菌菌落發(fā)生混淆，不易分辨，可同時作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經培養(yǎng)，而于4℃環(huán)境中放置，以便計數(shù)時作對照觀察。在某些場合，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在營養(yǎng)瓊脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培養(yǎng)后菌落呈紅色，易于分別。
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