人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的特點與應(yīng)用及培養(yǎng)操作規(guī)程!
小楊 / 2024-09-04 08:50:11
一、背景
人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞是一種常見的甲狀腺癌細(xì)胞類型,其惡性程度較低,生長緩慢,預(yù)后較好。在甲狀腺癌中,乳頭狀癌是最常見的一種類型,約占所有甲狀腺癌的60%左右。這種癌癥在年輕女性中較為常見,通常在40歲前發(fā)病。
人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞具有一些獨特的生物學(xué)特性。首先,它們通常表現(xiàn)為無痛性結(jié)節(jié),質(zhì)地較硬,活動度較差。其次,乳頭狀癌細(xì)胞容易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,但通常不會發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。此外,人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞對放射治療和內(nèi)分泌治療具有一定的敏感性,這有助于提高患者的生存率。
人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞是一種來源于人甲狀腺乳頭狀癌的細(xì)胞系。這種細(xì)胞系是通過將甲狀腺乳頭狀癌組織接種到裸鼠體內(nèi),然后從裸鼠體內(nèi)分離出腫瘤細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)而建立的。
貼壁生長:人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞在體外培養(yǎng)時,需要貼附在培養(yǎng)皿的底部,形成單層細(xì)胞。
多角形形態(tài):人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞呈多角形形態(tài),具有較大的胞體和多個短小的突起。
高增殖率:人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞具有較高的增殖率,可以在短時間內(nèi)達(dá)到較高的細(xì)胞密度。
表達(dá)特異性蛋白:人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞表達(dá)特異性的甲狀腺乳頭狀癌相關(guān)蛋白,如Thyroglobulin、Pax8等。
人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞在甲狀腺癌研究中具有廣泛的應(yīng)用,如用于研究甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移機(jī)制,以及藥物篩選、基因表達(dá)分析等。同時,由于其來源于人甲狀腺乳頭狀癌,因此在研究過程中可以更好地模擬甲狀腺癌的生理環(huán)境,提高研究的準(zhǔn)確性和可靠性。
1)復(fù)蘇人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞:以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考,具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min,棄去上清液,加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中,加入約8 mL培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜)。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞傳代:如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,使消化液浸潤所有細(xì)胞,棄去消化液,將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基,輕輕打勻后裝入無菌離心管中,1000 rpm離心4 min,棄去上清液,補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞凍存:待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時,可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例;
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液,裝入無菌離心管中,1000 rpm條件下離心4 min,棄去上清液,用PBS清洗一遍,棄盡PBS,進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液,使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL,輕輕混勻,每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液,注意凍存管做好標(biāo)識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱,24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
四、應(yīng)用
研究通過離體培養(yǎng)BRAFV600E基因突變型甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞即B-CPAP細(xì)胞,通過多種生物分子學(xué)技術(shù)檢測B-CPAP細(xì)胞較正常甲狀腺細(xì)胞中micro RNA-146b-3p表達(dá)水平的變化,中藥夏枯草作用于B-CPAP細(xì)胞對其micro RNA-146b-3p表達(dá)水平的影響,以及通過影響micro RNA-146b-3p的表達(dá)水平對B-CPAP細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)特性的改變,為甲狀腺乳頭狀癌尋找新的診療靶點,亦從分子水平為中藥夏枯草用于甲狀腺乳頭狀癌的臨床治療提供理論依據(jù)。
夏枯草對BRAFV600E基因突變型甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞micro RNA-146b-3p的影響:
1、細(xì)胞培養(yǎng):將BRAFV600E基因突變型甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞B-CPAP細(xì)胞、人甲狀腺正常細(xì)胞Nthy-ori 3-1細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA細(xì)胞分別按其相應(yīng)的適宜條件培養(yǎng)。
2、檢測中藥夏枯草的藥物安全性:將不同濃度夏枯草作用于EA細(xì)胞,通過CCK-8實驗檢測夏枯草的安全性。
3、檢測順鉑作用于B-CPAP細(xì)胞的最適濃度:人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞B-CPAP細(xì)胞中分別加入各個濃度的順鉑溶液,通過CCK-8實驗檢測其對B-CPAP細(xì)胞的最適作用濃度。
4、qRT-PCR法檢測人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞B-CPAP細(xì)胞相對Nthy-ori 3-1細(xì)胞micro RNA-146b-3p表達(dá)水平的變化以及夏枯草作用于人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞B-CPAP細(xì)胞對其micro RNA-146b-3p表達(dá)水平的影響。
夏枯草通過調(diào)控micro RNA-146b-3p對BRAFV600E基因突變型甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響:
1、CCK-8實驗檢測夏枯草通過抑制micro RNA-146b-3p表達(dá)對人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞B-CPAP細(xì)胞增殖能力的影響。
2、Transwell實驗檢測夏枯草通過抑制micro RNA-146b-3p表達(dá)對人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞B-CPAP細(xì)胞侵襲能力的影響。
3、細(xì)胞劃痕實驗檢測夏枯草通過抑制micro RNA-146b-3p表達(dá)對人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞B-CPAP細(xì)胞遷移能力的影響。
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