大鼠滑膜成纖維細(xì)胞的知識(shí)與應(yīng)用及培養(yǎng)操作步驟！
小楊 / 2025-01-03 09:25:50
一、背景
大鼠滑膜成纖維細(xì)胞是從大鼠的滑膜組織中分離出來(lái)的細(xì)胞，而滑膜組織是關(guān)節(jié)囊的內(nèi)層，淡紅色，平滑閃光，薄而柔潤(rùn)，由疏松結(jié)締組織組成。關(guān)節(jié)腔內(nèi)的所有結(jié)構(gòu)，除關(guān)節(jié)軟骨、半月軟骨板以外，即便是通過(guò)關(guān)節(jié)腔的肌腱、韌帶等均全部為滑膜所包裹?；し置诨?，在關(guān)節(jié)活動(dòng)中起重要作用。
滑膜細(xì)胞是構(gòu)成滑膜層的細(xì)胞群體，是維持關(guān)節(jié)正常功能的重要組織結(jié)構(gòu)，它包埋在顆粒狀無(wú)定性的基質(zhì)中，基質(zhì)內(nèi)有分散的纖維分布。這些細(xì)胞主要分為A型（巨噬樣滑膜細(xì)胞）、B型（成纖維樣滑膜細(xì)胞）以及C型（樹(shù)突細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞）。其中，A型和B型是最常見(jiàn)的。
大鼠滑膜成纖維細(xì)胞在關(guān)節(jié)炎等疾病的研究中具有重要意義。在關(guān)節(jié)炎等疾病狀態(tài)下，滑膜成纖維細(xì)胞會(huì)發(fā)生增生和分化，分泌炎性介質(zhì)和降解酶等，導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞和功能障礙。通過(guò)對(duì)大鼠滑膜成纖維細(xì)胞的研究，可以深入了解關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)病機(jī)制和治療方法。
1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）大鼠滑膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）大鼠滑膜成纖維細(xì)胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.收到細(xì)胞后首次傳代推薦將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，建議客戶凍存一支備用，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2到1:5的比例進(jìn)行。
3）大鼠滑膜成纖維細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
1，細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2，4min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x10E6/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
3，將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
大鼠滑膜成纖維細(xì)胞可以用于程氏蠲痹湯加減方對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜成纖維細(xì)胞Beclin1、LC3B表達(dá)的影響：
探討程氏蠲痹湯加減方(Modified Cheng’s Juanbi decoction,CJBD)對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Rrthritis,RA)發(fā)生作用的機(jī)制,觀察CJBD高、中、低不同劑量對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎(Adjuvant arthritis,AA)大鼠的一般狀態(tài)、體重、雙側(cè)足趾容積、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis index,AI)的變化,以及對(duì)血清中細(xì)胞因子白細(xì)胞介素4(Interleukin 4,IL-4)、白細(xì)胞介素17(Interleukin 17,IL-17),滑膜成纖維細(xì)胞中Beclin1、LC3B mRNA和蛋白相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平的作用,研究CJBD對(duì)AA大鼠滑膜成纖維細(xì)胞自噬產(chǎn)生的影響,為CJBD治療RA取得療效提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法：大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、CJBD低、中、高三個(gè)劑量組、甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)組。除了正常組,向其他組的大鼠右后足趾部位,注射0.15ml的弗氏完全佐劑(Freund’s adjuvant complete,CFA)致炎。致炎后第1d,采用病證結(jié)合的方式在AA模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行風(fēng)寒濕環(huán)境的刺激形成風(fēng)寒濕痹的中醫(yī)大鼠模型。模型復(fù)制成功后,CJBD低、中、高劑量組大鼠分別給予相應(yīng)劑量的CJBD藥液灌胃;MTX組給予相應(yīng)劑量的MTX懸混液灌胃;模型組、正常組給予相應(yīng)劑量的蒸餾水灌胃;各組均持續(xù)給藥28d。
評(píng)估CJBD對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠在治療前后的一般狀態(tài)、體重、雙側(cè)足趾容積、AI的影響;酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunoadsorption,ELISA)檢測(cè)大鼠血清中IL-4、IL-17的水平;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠滑膜成纖維細(xì)胞中Beclin1、LC3B mRNA的表達(dá)水平;免疫蛋白質(zhì)印記法(Western blotting,WB)檢測(cè)大鼠滑膜成纖維細(xì)胞中Beclin1、LC3B蛋白的表達(dá)水平。
結(jié)果：
1、一般狀態(tài)和體重比較發(fā)現(xiàn),與正常組相比,治療前的AA大鼠精神萎靡、飲食飲水減少、致炎側(cè)和繼發(fā)側(cè)足趾發(fā)紅腫脹明顯、活動(dòng)受限,并伴有毛發(fā)粗糙、鼻部充血等情況,呈進(jìn)行性加重趨勢(shì),體重增長(zhǎng)緩慢;與模型組對(duì)比,CJBD高、中、低劑量組和MTX組治療后的AA大鼠一般癥狀有所緩解,體重增長(zhǎng)緩慢得到改善(P<0.05);
2、雙側(cè)足趾容積比較發(fā)現(xiàn),與正常組比較,模型組、MTX組、CJBD高、中、低劑量組給藥前的雙側(cè)足趾容積顯著升高(P<0.05);與模型組對(duì)比,CJBD高、中、低劑量組以及MTX組治療后的AA大鼠雙側(cè)足趾容積減小,且CJBD高劑量組優(yōu)于CJBD中劑量組,CJBD中劑量組優(yōu)于CJBD低劑量組(P<0.05);
3、AI比較發(fā)現(xiàn),與模型組對(duì)比,CJBD高、中、低劑量組和MTX組治療后的AA大鼠AI評(píng)分下降(P<0.05),其中CJBD高劑量組AI評(píng)分的下調(diào)水平高于MTX組(P<0.05),MTX組與CJBD中劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),CJBD中劑量組與CJBD低劑量組有差異(P<0.05);
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