細(xì)胞培養(yǎng)中顆粒物產(chǎn)生的原因與應(yīng)對(duì)方法及預(yù)防措施！
小楊 / 2025-04-29 09:29:48
百歐博偉生物：在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，顆粒物的產(chǎn)生可能由多種因素引起，可能影響細(xì)胞狀態(tài)或?qū)嶒?yàn)結(jié)果的可靠性。以下是常見原因及應(yīng)對(duì)方法：
一、常見顆粒產(chǎn)生的原因
1、細(xì)胞碎片
原因：細(xì)胞死亡或機(jī)械損傷（如吹打過猛、離心速度過高）導(dǎo)致細(xì)胞裂解。
表現(xiàn)：顯微鏡下可見不規(guī)則碎片，培養(yǎng)液輕微渾濁。
2、微生物污染
細(xì)菌污染：培養(yǎng)液明顯渾濁，鏡下可見快速移動(dòng)的小顆粒。
真菌污染：出現(xiàn)絲狀或團(tuán)狀漂浮物。
支原體污染：無(wú)明顯渾濁，但細(xì)胞狀態(tài)異常（如生長(zhǎng)緩慢）。
3、血清或培養(yǎng)基沉淀
血清纖維蛋白析出：血清解凍不當(dāng)（如反復(fù)凍融或高溫解凍）導(dǎo)致纖維蛋白聚集。
培養(yǎng)基結(jié)晶：某些成分（如谷氨酰胺、碳酸鈣）在低溫保存時(shí)析出。
4、耗材碎屑
塑料器皿碎屑：低質(zhì)量培養(yǎng)瓶/離心管在操作中產(chǎn)生碎屑。
濾膜殘留：過濾培養(yǎng)基時(shí)濾膜破損或未徹底沖洗。
5、細(xì)胞分泌物
二、鑒別顆粒來源的方法
1、顯微鏡觀察：
低倍鏡觀察顆粒形態(tài)（規(guī)則結(jié)晶 vs 不規(guī)則碎片）。
高倍鏡觀察微生物運(yùn)動(dòng)性（細(xì)菌會(huì)游動(dòng)）。
2、無(wú)菌測(cè)試：
取培養(yǎng)液接種至肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)，檢測(cè)是否渾濁。
3、支原體檢測(cè)：
使用PCR試劑盒或Hoechst 33258熒光染色。
4、血清/培養(yǎng)基檢測(cè)：
更換批次或品牌，觀察是否仍有沉淀。
三、應(yīng)對(duì)方法
1、針對(duì)細(xì)胞碎片
優(yōu)化操作：輕柔吹打細(xì)胞，降低離心速度（建議100-200 ×g）。
提高細(xì)胞活力：更換新鮮培養(yǎng)基，調(diào)整傳代密度，避免過度生長(zhǎng)。
過濾：用40μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液。
2、針對(duì)微生物污染
嚴(yán)格無(wú)菌操作：超凈臺(tái)紫外滅菌30分鐘，規(guī)范使用酒精燈。
抗生素處理（僅限輕微細(xì)菌污染）：
添加雙抗（青霉素-鏈霉素，終濃度1%），但需注意抗生素可能抑制某些細(xì)胞生長(zhǎng)。
丟棄污染樣本：嚴(yán)重污染時(shí)需廢棄細(xì)胞，徹底清潔培養(yǎng)箱。
3、血清或培養(yǎng)基沉淀
正確解凍血清：4℃緩慢解凍，分裝保存，避免反復(fù)凍融。
預(yù)處理血清：使用前離心（2000 ×g, 5分鐘）去除沉淀。
培養(yǎng)基預(yù)熱：使用前37℃水浴預(yù)熱并輕輕搖勻。
4、耗材質(zhì)量問題
更換品牌：選擇高質(zhì)量無(wú)熱原的培養(yǎng)瓶/離心管。
預(yù)沖洗濾膜：過濾培養(yǎng)基前用PBS沖洗濾膜。
5、外泌體或囊泡
差異離心法：低速離心（300 ×g）去除細(xì)胞碎片后，超速離心（10,000 ×g以上）去除囊泡。
使用外泌體清除試劑。
四、預(yù)防措施
定期維護(hù)設(shè)備：清潔CO?培養(yǎng)箱水盤，避免真菌滋生。
分裝試劑：血清、培養(yǎng)基分裝后-20℃保存，減少反復(fù)凍融。
嚴(yán)格質(zhì)檢：新批次血清/培養(yǎng)基需預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
規(guī)范操作：避免金屬工具刮擦培養(yǎng)瓶底部。
五、處理流程示例
發(fā)現(xiàn)顆粒 → 顯微鏡初步判斷性質(zhì)。
若懷疑污染 → 無(wú)菌測(cè)試 + 支原體檢測(cè)。
確認(rèn)原因 → 針對(duì)性處理（如換液、過濾、丟棄污染樣本）。
預(yù)防復(fù)發(fā) → 優(yōu)化操作流程并記錄。
通過系統(tǒng)排查和規(guī)范操作，可有效減少顆粒物的干擾，保障細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性。
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