豬支原體培養(yǎng)基的作用原理與使用方法及常見問題與解決！
小楊 / 2025-05-15 09:14:03
豬支原體（如豬肺炎支原體 Mycoplasma hyopneumoniae）的培養(yǎng)基設(shè)計基于其特殊的營養(yǎng)需求和生長特性。以下從原理和使用方法兩方面進(jìn)行說明：
一、培養(yǎng)基原理
1、支原體的生物學(xué)特性
支原體是無細(xì)胞壁的原核生物，依賴宿主或培養(yǎng)基提供固醇類物質(zhì)和脂肪酸。
生長緩慢，對營養(yǎng)要求苛刻，需復(fù)雜培養(yǎng)基成分。
對青霉素等抑制細(xì)胞壁合成的抗生素不敏感，但培養(yǎng)基中常添加抗生素抑制雜菌。
2、關(guān)鍵培養(yǎng)基成分及作用
基礎(chǔ)培養(yǎng)基：常用改良的SP-4培養(yǎng)基，提供基礎(chǔ)碳源、氮源及礦物質(zhì)。
動物血清（如豬血清、馬血清）：提供膽固醇、脂肪酸和生長因子。
酵母提取物：補充維生素B群、核苷酸等。
葡萄糖：作為主要碳源，支原體通過糖酵解代謝。
pH指示劑（如酚紅）：監(jiān)測代謝產(chǎn)酸導(dǎo)致的pH變化。
抗生素（如青霉素、多黏菌素）：抑制革蘭氏陽性/陰性細(xì)菌污染。
二、使用方法
1、培養(yǎng)基配制（以改良Friis培養(yǎng)基為例）
配方示例：
基礎(chǔ)肉湯（胰蛋白胨、酵母提取物等）
葡萄糖（終濃度0.5-1%）
豬血清（10-20%）
青霉素（1000 IU/mL）
酚紅（0.002%）
步驟：
溶解基礎(chǔ)成分，調(diào)節(jié)pH至7.6-7.8。
高壓滅菌（121℃, 15分鐘），冷卻后無菌加入過濾除菌的血清和抗生素。
分裝至無菌試管或培養(yǎng)瓶，4℃保存?zhèn)溆谩?/div>
2、樣本處理與接種
樣本來源：豬肺組織、氣管拭子或支氣管肺泡灌洗液。
預(yù)處理：
組織樣本研磨后過濾（0.45 μm膜）去除雜菌。
液體樣本可離心富集后懸浮于培養(yǎng)基。
接種：按1:10比例將樣本加入培養(yǎng)基，避免過度稀釋。
3、培養(yǎng)條件
溫度：37℃恒溫。
氣體環(huán)境：微需氧（5% CO?）或厭氧罐中補充5% H? + 95% N?（部分菌株需要）。
培養(yǎng)時間：7-21天，定期觀察顏色變化（酚紅變黃提示產(chǎn)酸）。
4、觀察與鑒定
菌落特征：在固體培養(yǎng)基上形成細(xì)?。?.1-0.3 mm）、透明“煎蛋狀”菌落（中心致密，邊緣透明）。
鏡檢：吉姆薩染色可見多形性（球形、絲狀），無細(xì)胞壁。
代謝試驗：精氨酸水解或葡萄糖發(fā)酵試驗（依菌種而定）。
5、傳代與保存
傳代：取對數(shù)生長期培養(yǎng)物（pH顯著下降時），按10%接種量轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基。
保存：-80℃加入15%甘油或凍干保存。
三、注意事項
污染控制：支原體生長緩慢，易被雜菌掩蓋，嚴(yán)格無菌操作。
血清批次篩選：不同批次血清可能影響生長，需預(yù)實驗驗證。
氣體環(huán)境優(yōu)化：部分豬支原體需特定氣體比例，可嘗試調(diào)整CO?濃度。
生物安全：M. hyopneumoniae為豬呼吸道病原體，操作需在BSL-2實驗室進(jìn)行。
四、常見問題與解決
培養(yǎng)失?。簷z查血清活性、氣體環(huán)境或嘗試添加丙酮酸鈉（0.1%）促進(jìn)生長。
雜菌污染：增加抗生素濃度（如加萬古霉素50 μg/mL）或重新過濾樣本。
菌體自溶：及時傳代，避免培養(yǎng)時間過長。
通過上述步驟可有效培養(yǎng)
豬支原體，但其生長條件苛刻，需結(jié)合菌株特性調(diào)整培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)參數(shù)。
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