微生物限度檢測樣品不完全溶解的處理方法與操作步驟！
小楊 / 2025-06-03 09:50:44
百歐博偉生物：在微生物限度檢測中，遇到樣品不完全溶解的情況確實比較常見，特別是對于脂溶性基質、高分子材料或某些特殊配方的樣品（如軟膏、油劑、某些原料藥、化妝品、醫(yī)療器械浸提液等）。處理的關鍵在于既要保證樣品的均勻分散/溶解以提供具有代表性的測試樣本，又要確保處理過程不會對樣品中可能存在的微生物造成不可接受的損傷（殺死或抑制）。
以下是一些處理策略和步驟，請根據你的具體樣品特性和檢測標準選擇并驗證：
1、評估原因與性質：
什么成分不溶？ 是油脂、蠟質、高分子聚合物、不溶性粉末（如某些礦物粉）還是其他？
不溶物的狀態(tài)？ 是懸浮顆粒、乳化塊、沉淀還是油水分層？
檢測標準允許的范圍？ 查閱你遵循的特定藥典或標準中關于樣品制備和處理的規(guī)定。
首選策略：優(yōu)化溶解/分散條件 (溫和處理)：
延長攪拌/振蕩時間：在初始溶解步驟中，適當延長機械攪拌（如旋渦混合器）、振蕩（如水平振蕩器）或超聲處理（謹慎使用）的時間。確保溫度保持在室溫或標準規(guī)定的溫度（通常25±1°C），避免過熱殺死微生物。
提高溫度（謹慎且需驗證）：對于某些熔點稍高于室溫的油脂或蠟質，可以在嚴格控制的較低溫度（如不超過40-45°C，絕對避免超過45°C）下短暫加熱助溶，并立即冷卻至檢測溫度。必須通過方法適用性試驗（回收率試驗）驗證此步驟不會顯著影響微生物回收率。對于絕大多數(shù)微生物限度檢測，不建議加熱。
2、選擇合適的稀釋劑/溶解介質：
加入表面活性劑/乳化劑：這是處理油脂、油膏、軟膏等最常用且有效的方法。在稀釋液（如胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.1%蛋白胨水等）中加入適量的、對微生物無毒或低毒的表面活性劑。
常用選擇：聚山梨酯 80 (吐溫 80)、聚山梨酯 20 (吐溫 20)。濃度通常在0.1%到1% (v/v 或 w/v) 之間。必須通過方法適用性試驗確定最佳濃度并證明其不影響微生物回收。
使用有機溶劑（極謹慎，需嚴格驗證和證明無替代方案）：僅在絕對必要時，且確認對目標微生物無毒或毒性可接受、易揮發(fā)或易被后續(xù)稀釋中和的情況下使用。例如，對于某些極難溶的原料藥，可能先用少量無菌有機溶劑溶解，然后必須立即用足量的適宜稀釋液（含中和劑如吐溫80或卵磷脂等）進行高倍稀釋（通常稀釋倍數(shù)需足夠大，如100倍或以上），使有機溶劑濃度降至對微生物無影響的水平（通常<1%）。此方法風險較高，必須進行充分的方法學驗證（回收率試驗），證明全過程對微生物無殺滅或抑制作用，并且是最后的選擇。很多標準（尤其是藥品）不推薦或禁止使用有機溶劑。
使用特殊溶解介質：例如，對于含羊毛脂的樣品，有時使用含1%吐溫80和1%卵磷脂的稀釋液。卵磷脂有助于中和某些防腐劑和乳化。
3、物理分散/均質化 (適用于懸浮顆?；蜍浌腆w)：
機械均質：使用無菌的均質袋和拍打式均質器。將樣品放入無菌均質袋中，加入適量稀釋液（可含助溶劑），進行拍打均質。此法能有效破碎團塊，分散不溶性顆粒，使微生物釋放。需優(yōu)化拍打時間和速度，避免過熱。
研磨（謹慎）：對于非常硬的或難以均質的樣品，可在無菌研缽中用無菌稀釋液和無菌砂子進行研磨。需確保無菌操作，并驗證研磨過程對微生物的影響。風險相對較高。
高速分散/勻漿（謹慎）：使用實驗室高速分散機或勻漿機，必須嚴格控制轉速和時間，避免劇烈剪切產熱殺死微生物，并需驗證。
4、處理不完全溶解/分散的樣品：
保證充分混勻：無論采用何種方法處理，在取樣進行測試（傾注平皿或薄膜過濾）之前，必須確保樣品溶液/懸浮液被劇烈、充分地振搖或渦旋混勻，使微生物和不溶性物質盡可能均勻分布。
代表性取樣：在混勻后立即吸取樣品溶液。吸取時注意避免吸入大的氣泡或漂浮的團塊（除非團塊是樣品的一部分且需要測試），但應確保吸取的是包含懸浮顆粒的均勻混合物。
沉降法（風險較高，需驗證）：如果大的不溶性顆粒確實存在且難以分散，而標準允許或沒有更好辦法，有時會讓樣品靜置很短時間（如數(shù)秒），讓大的、快速沉降的非目標顆粒沉降，然后立即吸取上清液進行測試。這存在微生物隨顆粒沉降而導致低估的風險，必須通過方法適用性試驗驗證其回收率可接受。一般不推薦。
5、替代方法：薄膜過濾法：
如果樣品的不溶性物質會干擾平皿計數(shù)（如在瓊脂上形成覆蓋層或與瓊脂反應），或者即使經過上述處理仍無法獲得澄清溶液但能形成可過濾的均勻懸浮液，薄膜過濾法通常是更優(yōu)的選擇。
將樣品溶液/懸浮液（已充分混勻）通過無菌濾膜（孔徑通常為0.45µm）。微生物被截留在濾膜上，不溶性物質大部分也會被截留或通過（取決于顆粒大?。?。用適量的稀釋液沖洗濾膜以去除殘留的樣品基質（尤其是可能有抑菌性的成分），然后將濾膜轉移到瓊脂平板上培養(yǎng)。
此法能有效消除不溶性物質對計數(shù)的干擾，尤其適用于抑菌性樣品或含顆粒樣品。但也需進行方法適用性試驗，驗證沖洗步驟能有效去除抑菌成分且不影響微生物回收。
6、至關重要的步驟：方法適用性試驗（回收率試驗）：
無論你采用上述哪種處理方式（加助溶劑、加熱、均質、過濾等），都必須對處理后的整個檢測方法進行適用性試驗。
計算回收率：比較經樣品處理后的微生物回收數(shù)與直接接種到稀釋液/培養(yǎng)基中的微生物回收數(shù)。
要求：回收率通常應不低于70%（或符合所遵循標準的具體要求，如藥典規(guī)定需證明試驗組與對照組回收率比值在0.5-2.0之間）。
目的：證明你所采用的溶解/分散/處理方法沒有對微生物造成不可接受的損傷，并且該方法能有效檢出樣品中可能存在的微生物。
7、總結與關鍵點：
優(yōu)先嘗試溫和方法：延長攪拌、添加低濃度表面活性劑（如0.1-1% 吐溫80）、機械均質/拍打。
謹慎使用加熱和有機溶劑：僅在必要時，嚴格控溫/濃度，并必須通過回收率驗證。
充分混勻是核心：任何方法處理后，取樣前必須劇烈振搖/渦旋混勻。
薄膜過濾法是重要備選：特別適用于干擾平皿計數(shù)或難以完全溶解但有懸浮液的樣品。
方法適用性試驗是強制要求：任何偏離標準溶解程序的步驟都必須經過嚴格的回收率試驗驗證其有效性，證明不影響微生物檢出。
記錄：詳細記錄樣品處理的所有步驟、使用的助溶劑種類濃度、處理條件（時間、溫度、速度等）以及方法適用性試驗的結果。
請務必參考你所遵循的特定藥典章節(jié)或相關ISO標準中關于樣品制備和處理的詳細規(guī)定和指導原則。在實施任何變更前，最好與實驗室負責人或質量部門溝通確認。
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