乳酸桿菌選擇性瓊脂的原理與使用方法及注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-06-05 09:33:29
乳酸桿菌選擇性瓊脂是一種專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)用于從復(fù)雜樣本（如食品、飲料、臨床標(biāo)本、環(huán)境樣本）中分離和初步鑒定乳酸桿菌的固體培養(yǎng)基。其核心在于“選擇性”和“指示性”。
一、原理
1、選擇性原理 (抑制非目標(biāo)菌)：
低 pH 環(huán)境：培養(yǎng)基通常調(diào)整至較低的初始 pH（約 5.4 - 5.6）。這個(gè)酸性環(huán)境不利于大多數(shù)非乳酸桿菌的細(xì)菌（尤其是許多革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽(yáng)性菌）生長(zhǎng)，而乳酸桿菌本身耐酸甚至嗜酸，能在此環(huán)境下良好生長(zhǎng)。
抗生素 (常見(jiàn)配方)：許多商業(yè)化的乳酸桿菌選擇性瓊脂會(huì)添加萬(wàn)古霉素（或其他針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抗生素）。萬(wàn)古霉素能有效抑制絕大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌（如
葡萄球菌、
鏈球菌、
腸球菌、
芽孢桿菌等），但乳酸桿菌（特別是乳桿菌屬）通常對(duì)其具有天然抗性。這極大地提高了對(duì)乳酸桿菌的選擇性。
其他抑制劑 (可選)：有些配方可能添加其他抑制劑，如抗真菌劑來(lái)抑制酵母和霉菌的生長(zhǎng)。
2、指示性原理 (初步鑒定乳酸桿菌)：
pH 指示劑：培養(yǎng)基中含有溴甲酚紫。這是一種 pH 指示劑，變色范圍大約在 pH 5.2 (黃色) 到 pH 6.8 (紫色) 之間。
產(chǎn)酸反應(yīng)：乳酸桿菌的主要特征之一是發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸等有機(jī)酸。當(dāng)目標(biāo)乳酸桿菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并代謝其中的糖類(lèi)（通常是葡萄糖）時(shí)，會(huì)產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物。
顏色變化：產(chǎn)生的酸導(dǎo)致培養(yǎng)基局部 pH 值顯著下降，使得溴甲酚紫指示劑從紫色（中性/弱堿性）變?yōu)辄S色（酸性）。因此，在菌落周?chē)鷷?huì)出現(xiàn)一個(gè)明顯的黃色暈圈。這個(gè)黃色暈圈是初步鑒定為乳酸桿菌的重要視覺(jué)指標(biāo)。
緩沖鹽與碳酸鈣 (可選)：有些配方添加：
緩沖鹽：幫助維持一定的緩沖能力，防止培養(yǎng)基過(guò)快酸化而抑制乳酸桿菌自身生長(zhǎng)。
碳酸鈣 (CaCO?)：懸浮在瓊脂中，呈不透明的白色沉淀。乳酸桿菌產(chǎn)生的酸會(huì)溶解其周?chē)奶妓徕}，在黃色菌落周?chē)纬赏该鞯乃馊?。這提供了另一個(gè)直觀的產(chǎn)酸證據(jù)（但并非所有配方都含碳酸鈣）。
3、營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)：
提供適合乳酸桿菌生長(zhǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)成分，如蛋白胨、酵母提取物等。
常含有番茄汁或番茄浸粉：番茄汁富含乳酸桿菌生長(zhǎng)所需的維生素、氨基酸和其他生長(zhǎng)因子，能顯著促進(jìn)其生長(zhǎng)，并增強(qiáng)其產(chǎn)生典型菌落特征的能力。這是區(qū)分不同種類(lèi)乳酸桿菌選擇性瓊脂的一個(gè)重要特征。
二、使用方法
1、培養(yǎng)基準(zhǔn)備：
根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)稱(chēng)取適量的脫水培養(yǎng)基粉末。
加入規(guī)定體積的蒸餾水或去離子水。
加熱溶解并煮沸：充分?jǐn)嚢璨⒓訜嶂镣耆芙?，通常需要短暫煮沸?/div>
滅菌：121°C (15 psi) 高壓蒸汽滅菌 15 分鐘。 滅菌后培養(yǎng)基應(yīng)為均勻的紫色（含溴甲酚紫）。
冷卻：將滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至約 45-50°C（手感溫?zé)岬粻C手）。
添加抗生素 (如果需要)：如果購(gòu)買(mǎi)的培養(yǎng)基粉末不含抗生素，或需要額外添加特定抗生素（如萬(wàn)古霉素），需在培養(yǎng)基冷卻至合適溫度后，無(wú)菌操作加入無(wú)菌過(guò)濾除菌的抗生素溶液，并輕輕混勻（避免產(chǎn)生氣泡）。
倒平板：在無(wú)菌條件下，將培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中（約 15-20 ml/90mm 平皿）。讓培養(yǎng)基在水平臺(tái)面上凝固。凝固后應(yīng)為均勻的紫色（含溴甲酚紫）或不透明（含碳酸鈣）。
2、樣品處理：
根據(jù)樣本類(lèi)型（食品、飲料、糞便、發(fā)酵液等）進(jìn)行適當(dāng)?shù)木|(zhì)化（如使用均質(zhì)袋、勻漿器）。
制備系列稀釋液（通常用無(wú)菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液），以獲得適合計(jì)數(shù)的菌落數(shù)（目標(biāo) 30-300 CFU/平板）。
3、接種：
涂布法 (最常用)：取適量（通常是 0.1 ml）的樣品原液或適當(dāng)稀釋度的稀釋液，滴加到凝固的瓊脂平板中央。
用無(wú)菌的 L 形玻璃棒或一次性涂布棒，將液體均勻涂布在整個(gè)平板表面。確保液體被瓊脂吸收。
傾注法 (可選，較少用)：取 1 ml 樣品稀釋液加入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，再傾入約 15 ml 冷卻至約 45°C 的瓊脂培養(yǎng)基，立即混勻，靜置凝固。
4、培養(yǎng)：
溫度：通常推薦在 30-37°C 下培養(yǎng)。具體溫度可能根據(jù)目標(biāo)乳酸桿菌種類(lèi)調(diào)整（如
嗜熱鏈球菌可能需要 42-45°C）。
氣氛：厭氧或微需氧環(huán)境對(duì)于許多乳酸桿菌（尤其是乳桿菌屬）的旺盛生長(zhǎng)至關(guān)重要。常用方法：
厭氧罐/袋：使用厭氧產(chǎn)氣袋或抽氣換氣系統(tǒng)（通入 N?/CO?/H? 混合氣）創(chuàng)造厭氧環(huán)境。
蠟燭罐：提供一個(gè)微需氧環(huán)境（約 3-5% CO?），對(duì)某些兼性厭氧的乳酸桿菌也有效。
(注意：在普通有氧條件下培養(yǎng)，乳酸桿菌可能生長(zhǎng)緩慢、菌落變小或不產(chǎn)酸暈，導(dǎo)致低估或漏檢）。
時(shí)間：通常培養(yǎng) 48-72 小時(shí)。有些生長(zhǎng)緩慢的菌株可能需要更長(zhǎng)的時(shí)間（最多 5 天）。定期觀察。
5、結(jié)果判讀：
典型乳酸桿菌菌落：
菌落通常較?。?-3 mm）、圓形、凸起、光滑、不透明（奶油色、白色或米黃色）。
最關(guān)鍵的特征：菌落周?chē)幸粋€(gè)明顯的黃色暈圈（產(chǎn)酸區(qū)）。 這是初步鑒定為乳酸桿菌的主要依據(jù)。
(含碳酸鈣的配方)：在黃色暈圈內(nèi)，菌落周?chē)赡苓€有一個(gè)清晰的透明圈（碳酸鈣被溶解的區(qū)域）。
計(jì)數(shù)：計(jì)數(shù)具有典型形態(tài)（特別是帶有清晰黃色暈圈）的菌落，乘以稀釋倍數(shù)，報(bào)告為樣品中乳酸桿菌的數(shù)量（CFU/g 或 CFU/ml）。
非目標(biāo)菌：非乳酸桿菌的細(xì)菌通常被抑制（不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)極差）。如果生長(zhǎng)，其菌落周?chē)ǔ](méi)有黃色暈圈（保持紫色或僅輕微變色）。
三、重要注意事項(xiàng)
選擇性非絕對(duì)：
培養(yǎng)基的選擇性并非 100%。極少數(shù)非乳酸桿菌的耐酸菌或?qū)λ每股赜锌剐缘木ㄈ缒承┠c球菌）也可能生長(zhǎng)，甚至偶爾產(chǎn)酸（假陽(yáng)性）。
并非所有乳酸桿菌都能在特定配方上生長(zhǎng)良好或產(chǎn)生典型暈圈（假陰性）。不同屬/種的乳酸桿菌對(duì)生長(zhǎng)條件（溫度、厭氧程度、營(yíng)養(yǎng)需求）的偏好不同。
初步鑒定：乳酸桿菌選擇性瓊脂上的典型菌落只能作為乳酸桿菌存在的初步指示。必須通過(guò)進(jìn)一步的生化試驗(yàn)、顯微鏡形態(tài)觀察（革蘭氏陽(yáng)性桿菌/球菌、無(wú)芽孢）或分子生物學(xué)方法來(lái)確認(rèn)鑒定到屬或種的水平。
培養(yǎng)條件至關(guān)重要：提供合適的厭氧/微需氧環(huán)境對(duì)獲得可靠結(jié)果極為重要。
配方差異：不同廠商或不同名稱(chēng)的乳酸桿菌選擇性瓊脂在具體成分（番茄汁含量、緩沖體系、是否含碳酸鈣、抗生素種類(lèi)）上可能有差異。務(wù)必遵循所用特定產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作和結(jié)果解釋。
質(zhì)控：建議使用已知的標(biāo)準(zhǔn)乳酸桿菌菌株（陽(yáng)性對(duì)照）和非乳酸桿菌菌株（陰性對(duì)照）進(jìn)行質(zhì)控，驗(yàn)證培養(yǎng)基的選擇性和指示性能。
樣品復(fù)雜性：對(duì)于含有大量競(jìng)爭(zhēng)菌或抑制物的復(fù)雜樣品（如糞便、某些發(fā)酵食品），可能需要更高的稀釋度或額外的樣品預(yù)處理步驟。
存儲(chǔ)：制備好的平板應(yīng)儲(chǔ)存在 2-8°C（避光），并在保質(zhì)期內(nèi)使用。使用前恢復(fù)至室溫。
總結(jié)：
乳酸桿菌選擇性瓊脂通過(guò)低 pH 和/或抗生素抑制非目標(biāo)菌，利用溴甲酚紫（和/或碳酸鈣）指示產(chǎn)酸能力，并結(jié)合番茄汁等營(yíng)養(yǎng)成分，實(shí)現(xiàn)對(duì)乳酸桿菌的選擇性分離和初步鑒定。正確的樣品處理、接種、以及關(guān)鍵性的厭氧/微需氧培養(yǎng)條件是獲得準(zhǔn)確可靠結(jié)果的基礎(chǔ)。陽(yáng)性結(jié)果需經(jīng)確認(rèn)試驗(yàn)證實(shí)。
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