銅綠假單胞菌的保存溫度問題及操作方法與注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-06-06 09:26:04
銅綠假單胞菌是一種對環(huán)境適應(yīng)力較強(qiáng)的革蘭氏陰性桿菌，其保存溫度取決于保存的目的和期限。
以下是不同保存方法推薦的核心溫度：
一、短期保存 (數(shù)天至1個月)：
溫度：4°C
方法：在營養(yǎng)瓊脂斜面或平板上生長后，置于4°C冰箱。
注意事項(xiàng)：
這是最常用的短期工作菌株保存方法。
保存時間通常不超過1個月。超過這個時間，細(xì)菌活力會明顯下降，可能出現(xiàn)變異或死亡。
需要定期（一般每月一次）轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基上傳代保存。
平板應(yīng)密封以防干燥。斜面塞緊塞子或用封口膜封口。
二、中期保存 (1-6個月)：
溫度：4°C
方法：半固體瓊脂穿刺保存法。
使用含0.5%-0.7%瓊脂的營養(yǎng)半固體培養(yǎng)基（如營養(yǎng)肉湯加瓊脂）。
用接種針穿刺接種到培養(yǎng)基深部。
培養(yǎng)生長后，擰緊管蓋或用Parafilm密封，直立放置于4°C冰箱。
優(yōu)點(diǎn)：比普通斜面保存時間長，可達(dá)3-6個月，操作相對簡單。
注意事項(xiàng)：仍需注意密封防干燥。
三、長期保存 (6個月至數(shù)年甚至更久)：
溫度：-70°C 至 -80°C (首選) 或 液氮?dú)庀?(-150°C 至 -196°C)
方法：
超低溫冷凍保存：這是最常用、最可靠的長期保存方法。
將生長旺盛的菌懸液（通常用對數(shù)生長期的菌體）與冷凍保護(hù)劑（如15%-25% (v/v) 甘油或5%-10% (v/v) DMSO）混合均勻。
分裝到無菌的冷凍保存管中。
快速冷凍：將凍存管直接放入-70°C 或 -80°C 超低溫冰箱，或先在干冰/異丙醇?。s-70°C）中預(yù)冷數(shù)小時，再轉(zhuǎn)入超低溫冰箱。避免使用普通 -20°C 冰箱進(jìn)行長期保存，因?yàn)樵摐囟认卤纬蓵斐杉?xì)胞損傷，菌株存活率會隨時間急劇下降。
復(fù)蘇：需要時，快速取出凍存管（避免在室溫下長時間停留），立即置于37°C - 40°C 水浴中快速振蕩融化，然后盡快接種到合適的培養(yǎng)基上。
冷凍干燥 (凍干) 保存：
將菌懸液（通常加有保護(hù)劑如脫脂牛奶、蔗糖等）分裝到安瓿瓶中，在冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍和真空干燥。
凍干完成后，在真空或充惰性氣體（如氮?dú)猓l件下密封安瓿瓶。
保存于4°C 或 -20°C 暗處。
優(yōu)點(diǎn)：保存期極長（可達(dá)數(shù)十年），便于運(yùn)輸，菌種穩(wěn)定性好。
缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，需要專用設(shè)備，復(fù)蘇時操作要求較高。
注意事項(xiàng)：
-70°C / -80°C 優(yōu)于 -20°C：普通家用或?qū)嶒?yàn)室的 -20°C 冰箱不適合長期保存微生物（包括
銅綠假單胞菌），因?yàn)榇藴囟认卤С掷m(xù)生長，會嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞膜和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致存活率低且不穩(wěn)定。必須使用超低溫冰箱 (-70°C 或更低) 或液氮。
保護(hù)劑至關(guān)重要：甘油或DMSO能降低冰點(diǎn)，減少冰晶形成，保護(hù)細(xì)胞。
快速冷凍和快速復(fù)蘇：盡量減少冰晶對細(xì)胞的傷害。
避免反復(fù)凍融：每次復(fù)蘇后應(yīng)使用新的凍存管，避免反復(fù)凍融同一管菌液，這會極大降低存活率。
總結(jié)與建議：
日常短期使用 (1個月內(nèi))：4°C 斜面或平板保存，定期傳代。
中期保存 (幾個月)：4°C 半固體瓊脂穿刺保存。
長期穩(wěn)定保存 (6個月以上)：首選 -70°C / -80°C 超低溫冷凍保存（加15-25%甘油或5-10% ）。絕對避免使用 -20°C 進(jìn)行長期保存。
超長期或菌種庫保存：冷凍干燥保存 (4°C 或 -20°C)。
選擇哪種方法取決于您的具體需求：
如果只是需要經(jīng)常使用的菌株，4°C斜面保存最方便。
如果需要保存幾個月且不想頻繁傳代，半固體穿刺法是個折中選擇。
如果需要保存菌株作為重要資源、備用或長期研究，-70°C / -80°C 冷凍保存是最可靠、最推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法。
重要提示：
標(biāo)記清晰：無論哪種方法，務(wù)必清楚標(biāo)記菌株名稱、保存日期、保存方法（如甘油濃度）和傳代次數(shù)。
復(fù)蘇后驗(yàn)證：長期保存后復(fù)蘇的菌株，建議進(jìn)行關(guān)鍵特性（如形態(tài)、生化特性、藥敏譜等）的驗(yàn)證，確保沒有發(fā)生變異。
菌株差異：雖然
銅綠假單胞菌總體耐受力較強(qiáng)，但不同菌株對冷凍保存的敏感性可能略有差異。對于特別重要的菌株，可先小規(guī)模測試保存效果。
參考標(biāo)準(zhǔn)流程：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)的菌種保存操作規(guī)程 (SOP)。參考權(quán)威菌種保藏中心提供的針對特定菌株的保存建議也是很好的做法。
總之，對于
銅綠假單胞菌的長期保存，-70°C / -80°C 超低溫冷凍加甘油保護(hù)劑是最常用、最可靠的方法。
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