細(xì)胞培養(yǎng)中動(dòng)物血清的常見問題及處理方法與預(yù)防措施！
小楊 / 2025-06-06 09:56:47
動(dòng)物血清（尤其是
胎牛血清，F(xiàn)BS）是細(xì)胞培養(yǎng)中不可或缺的培養(yǎng)基添加劑，提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素、生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白等。然而，在使用過程中會(huì)遇到各種問題。了解這些問題及其處理方法對(duì)于保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性至關(guān)重要。
一、常見問題
1、沉淀/絮狀物：
表現(xiàn)：血清解凍后出現(xiàn)白色、棕色或絮狀沉淀物，懸浮或沉于瓶底。
原因：
纖維蛋白/纖維蛋白原：這是最常見的原因，凝血過程中形成，尤其在反復(fù)凍融或溫度波動(dòng)時(shí)析出。
磷酸鈣：血清中鈣離子和磷酸根離子在特定條件下（如pH、溫度變化）結(jié)合形成。
脂蛋白：血清中的脂類在低溫或長(zhǎng)期保存時(shí)聚集。
蛋白聚合物：血清蛋白變性或聚集。
微粒：過濾不徹底或儲(chǔ)存過程中產(chǎn)生。
影響：堵塞濾膜、影響細(xì)胞狀態(tài)（物理刺激、消耗養(yǎng)分）、影響實(shí)驗(yàn)觀察（如顯微鏡下）。
2、顏色異常：
表現(xiàn)：
淡黃色/稻草黃：正常顏色。
深黃色/琥珀色：通常由于保存時(shí)間過長(zhǎng)或儲(chǔ)存溫度偏高導(dǎo)致血紅蛋白（血紅素）氧化。
粉紅色/紅色：明顯的血紅蛋白污染（溶血），通常由于采血過程處理不當(dāng)或凍融過程劇烈導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂。
渾濁/云霧狀：可能指示細(xì)菌污染或高脂血清。
影響：深色可能不影響細(xì)胞生長(zhǎng)，但影響光學(xué)觀察。粉紅色/紅色指示溶血，可能影響某些細(xì)胞類型（如神經(jīng)元）。渾濁需警惕污染。
3、微生物污染：
表現(xiàn)：
細(xì)菌：培養(yǎng)基迅速渾濁、pH急劇下降（變黃）、鏡下可見大量活動(dòng)小點(diǎn)。
真菌/酵母：培養(yǎng)基中出現(xiàn)絮狀、絲狀或點(diǎn)狀懸浮物，pH變化，鏡下可見菌絲或孢子。
支原體：培養(yǎng)基可能無(wú)明顯渾濁，但細(xì)胞狀態(tài)變差（生長(zhǎng)緩慢、形態(tài)改變、易脫落、代謝異常），檢測(cè)需要特殊方法（PCR、DNA染色、培養(yǎng)法）。
病毒：更難檢測(cè)，可能通過影響細(xì)胞表型或PCR等方法發(fā)現(xiàn)。
原因：血清生產(chǎn)、分裝、運(yùn)輸、儲(chǔ)存或使用過程中無(wú)菌操作不當(dāng)引入。
影響：導(dǎo)致細(xì)胞死亡、實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效、交叉污染整個(gè)實(shí)驗(yàn)室。
4、細(xì)胞生長(zhǎng)不良/毒性：
表現(xiàn)：細(xì)胞貼壁差、增殖緩慢、形態(tài)異常、死亡率高、達(dá)不到預(yù)期密度。
原因：
血清質(zhì)量差：來源動(dòng)物健康狀況差、生產(chǎn)工藝不佳、內(nèi)毒素含量高、激素/生長(zhǎng)因子水平不足或不穩(wěn)定。
批次差異：不同批次血清的成分（特別是生長(zhǎng)因子、激素）存在自然差異。
滅活處理不當(dāng)：過度滅活（溫度過高、時(shí)間過長(zhǎng)）破壞有益成分或產(chǎn)生毒性物質(zhì)。
污染：特別是支原體或病毒污染。
沉淀物影響：物理刺激或消耗養(yǎng)分。
儲(chǔ)存條件不當(dāng)：反復(fù)凍融、長(zhǎng)期置于4°C或更高溫度導(dǎo)致成分降解。
影響：實(shí)驗(yàn)失敗，結(jié)果不可靠，時(shí)間和資源浪費(fèi)。
5、批次間差異：
表現(xiàn)：同一細(xì)胞系使用不同批次的血清，生長(zhǎng)速度、形態(tài)、代謝或特定功能表達(dá)不一致。
原因：血清是天然產(chǎn)物，其成分受動(dòng)物品種、年齡、地理位置、季節(jié)、飲食、采血和加工方法等多種因素影響，無(wú)法做到完全均一。
影響：實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性差，更換批次時(shí)需要重新優(yōu)化條件或驗(yàn)證。
二、處理方法與預(yù)防措施
1、沉淀/絮狀物處理：
輕微沉淀（常見纖維蛋白）：解凍后，溫和地將血清在2-8°C冰箱中靜置過夜，讓大部分沉淀沉底。然后小心吸取上清液使用（避免攪動(dòng)沉淀）。通常不需要過濾去除，過度過濾會(huì)損失生長(zhǎng)因子。
大量沉淀或懷疑其他類型沉淀：
離心：在2-8°C，以約2000-4000g離心5-10分鐘，小心吸取上清液。
過濾：如果必須去除（例如做無(wú)血清實(shí)驗(yàn)或特殊要求），使用孔徑≥0.45μm的低蛋白吸附濾膜過濾（0.22μm過濾會(huì)顯著損失有效成分）。僅在必要時(shí)進(jìn)行！
預(yù)防：
避免反復(fù)凍融：購(gòu)買后立即分裝成小份（如50ml），儲(chǔ)存于-20°C（短期1-2年）或最佳為-70°C至-80°C（長(zhǎng)期保存）。
規(guī)范解凍：從-20°C/-80°C取出后，先置于2-8°C冰箱過夜解凍，然后在室溫下輕輕搖勻。避免水浴快速解凍或置于37°C（溫度驟變易致沉淀）。
輕柔操作：解凍和混勻時(shí)動(dòng)作輕柔，避免劇烈搖晃或產(chǎn)生氣泡。
儲(chǔ)存溫度恒定：長(zhǎng)期儲(chǔ)存務(wù)必在-70°C至-80°C。
2、顏色異常處理與預(yù)防：
輕微深黃色：如果細(xì)胞生長(zhǎng)正常，通常可接受。但新批次建議先測(cè)試。
粉紅色/紅色（溶血）：溶血血清可能含有高水平的游離鐵和血紅蛋白，對(duì)某些細(xì)胞有毒或影響實(shí)驗(yàn)。
渾濁：高度懷疑污染，立即停止使用并丟棄！徹底清潔相關(guān)區(qū)域。
預(yù)防：
選擇信譽(yù)良好、質(zhì)檢嚴(yán)格的供應(yīng)商。
嚴(yán)格遵循儲(chǔ)存條件（-70°C至-80°C），避免在4°C長(zhǎng)期存放（>1個(gè)月）。
規(guī)范解凍操作（見沉淀預(yù)防）。
3、微生物污染處理與預(yù)防：
一旦發(fā)現(xiàn)或懷疑污染（細(xì)菌、真菌）：
立即隔離：將污染的培養(yǎng)物、培養(yǎng)基、血清、耗材等密封后高壓滅菌或浸泡消毒液。
徹底消毒：對(duì)培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)、實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、移液器等進(jìn)行徹底消毒（消毒劑擦拭、紫外照射、必要時(shí)甲醛熏蒸）。
丟棄：污染的血清必須丟棄。
支原體污染：
檢測(cè)確認(rèn)：使用PCR或?qū)I(yè)檢測(cè)試劑盒確認(rèn)。
處理極其困難：通常建議丟棄所有污染的細(xì)胞株、培養(yǎng)基和可能污染的試劑（包括該瓶血清），徹底清潔環(huán)境，啟用新的細(xì)胞株和試劑。使用支原體清除試劑處理珍貴細(xì)胞株是最后手段，但風(fēng)險(xiǎn)高且可能不徹底。
病毒污染：檢測(cè)和處理更復(fù)雜，通常需要丟棄并徹底消毒。
預(yù)防（重中之重?。?/div>
無(wú)菌操作：嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程（在超凈臺(tái)內(nèi)操作，使用無(wú)菌耗材，穿戴實(shí)驗(yàn)服手套，酒精消毒手和臺(tái)面）。
定期檢測(cè)：對(duì)新批次血清進(jìn)行無(wú)菌測(cè)試（細(xì)菌/真菌培養(yǎng)）和支原體檢測(cè)（PCR或?qū)I(yè)試劑盒）。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物定期進(jìn)行支原體檢測(cè)（如每月一次）。
規(guī)范分裝使用：血清分裝和使用時(shí)保持無(wú)菌環(huán)境，避免將同一吸管/移液頭反復(fù)插入血清瓶中。取用后及時(shí)蓋緊瓶蓋。
添加抗生素：在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)濃度的抗生素（如青霉素-鏈霉素）可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但不能替代無(wú)菌操作，且對(duì)支原體/真菌效果有限或無(wú)效。
選擇輻照血清：伽馬輻照處理能有效滅活血清中可能存在的病毒、支原體等微生物，推薦使用，尤其用于珍貴細(xì)胞或嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)。注意輻照對(duì)血清成分可能有輕微影響。
4、細(xì)胞生長(zhǎng)不良/毒性處理與預(yù)防：
處理：
更換血清批次：首要嘗試。選擇經(jīng)質(zhì)檢合格的新批次。
血清測(cè)試：對(duì)新批次血清進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)試（倍增時(shí)間測(cè)定）和內(nèi)毒素檢測(cè)（LAL法）。選擇最適合自己細(xì)胞系的批次。
調(diào)整濃度：嘗試降低或提高血清濃度（但常用濃度范圍是5%-20%）。
避免滅活：除非實(shí)驗(yàn)明確要求（如補(bǔ)體依賴實(shí)驗(yàn)），盡量避免熱滅活，因?yàn)楸状笥诶ㄆ茐纳L(zhǎng)因子，可能產(chǎn)生沉淀）。
預(yù)防：
嚴(yán)格供應(yīng)商選擇：選擇提供詳細(xì)質(zhì)檢報(bào)告（包括內(nèi)毒素水平、理化指標(biāo)、無(wú)菌支原體檢測(cè)、生長(zhǎng)促進(jìn)測(cè)試）的知名品牌供應(yīng)商。
索要并查看質(zhì)檢報(bào)告：購(gòu)買前務(wù)必索取并仔細(xì)閱讀該批次的質(zhì)檢報(bào)告（CoA）。
批次測(cè)試：對(duì)于關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)或珍貴細(xì)胞系，務(wù)必對(duì)新批次血清進(jìn)行小規(guī)模細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)試，合格后再大量使用。
預(yù)留庫(kù)存：對(duì)于驗(yàn)證過的好批次，盡量多購(gòu)買一些同一批次的血清，分裝凍存?zhèn)溆谩?/div>
規(guī)范儲(chǔ)存與解凍：如前所述。
5、批次間差異處理與預(yù)防：
處理：
批次測(cè)試：每次更換新批次前必須進(jìn)行嚴(yán)格的細(xì)胞生長(zhǎng)和功能測(cè)試，確保能滿足實(shí)驗(yàn)要求。
混合使用：在舊批次快用完時(shí)，提前引入新批次血清，新舊批次按比例混合使用一段時(shí)間，讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)。
預(yù)留庫(kù)存：同上。
預(yù)防：
選擇來源穩(wěn)定、質(zhì)檢嚴(yán)格的供應(yīng)商：大品牌通常能提供相對(duì)更穩(wěn)定的產(chǎn)品。
盡量使用同一批次：對(duì)于長(zhǎng)期項(xiàng)目，一次性購(gòu)買足夠量的同一批次血清。
詳細(xì)記錄：對(duì)使用的每一瓶血清的批次號(hào)進(jìn)行詳細(xì)記錄。
重要注意事項(xiàng)：
血清驗(yàn)收：新批次血清到貨后，檢查外觀（顏色、是否溶血、有無(wú)大量沉淀）、包裝完整性、標(biāo)簽信息（批號(hào)、有效期、儲(chǔ)存條件）是否與訂單一致。核對(duì)供應(yīng)商提供的質(zhì)檢報(bào)告（CoA）。
滅活的爭(zhēng)議：除非實(shí)驗(yàn)特殊需要（如滅活補(bǔ)體），越來越多的證據(jù)表明熱滅活通常是不必要的，且可能有害（破壞生長(zhǎng)因子、增加沉淀風(fēng)險(xiǎn)）。僅在明確需要時(shí)才進(jìn)行滅活（56°C水浴30分鐘，期間輕輕搖動(dòng)幾次）。
血清替代物：對(duì)于某些細(xì)胞類型或特定研究目的（如研究生長(zhǎng)因子作用、生產(chǎn)治療性蛋白），可考慮使用化學(xué)成分明確的無(wú)血清培養(yǎng)基或添加特定生長(zhǎng)因子的血清替代物，以消除批次差異和動(dòng)物源性風(fēng)險(xiǎn)。
總結(jié)：
有效管理動(dòng)物血清的關(guān)鍵在于：嚴(yán)格供應(yīng)商選擇與質(zhì)檢報(bào)告審核、規(guī)范儲(chǔ)存（-70°C至-80°C分裝）與解凍（2-8°C過夜）、嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程、對(duì)新批次進(jìn)行嚴(yán)格的細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)試、避免不必要的熱滅活、警惕沉淀和顏色變化、定期檢測(cè)支原體、預(yù)留同批次庫(kù)存并做好詳細(xì)記錄。通過采取這些預(yù)防措施和及時(shí)處理問題，可以最大程度地減少血清相關(guān)問題對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的影響。
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