大腸菌群平板計數(shù)法的操作步驟與要點及常見問題與解決！
小楊 / 2025-06-20 09:47:27
百歐博偉生物：大腸菌群平板計數(shù)法是檢測食品、水質等樣品中大腸菌群數(shù)量的常用方法，其操作要點在于無菌操作、準確稀釋、均勻涂布/傾注、典型菌落識別和確證實驗。以下是詳細的操作要點及注意事項：
一、 主要操作步驟與要點
1、樣品制備與稀釋
無菌操作：全程在超凈臺/酒精燈旁進行，器材需121℃滅菌20分鐘。
均質化：固體樣品按1:10（如25g樣品+225mL無菌生理鹽水）均質，液體樣品直接稀釋。
梯度稀釋：做10倍系列稀釋（10?¹, 10?², 10?³...），每稀釋一次更換無菌吸管。
2、傾注平板
培養(yǎng)基準備：結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）加熱溶解，冷卻至45~50℃（溫度過高會殺死細菌，過低則凝固）。
加樣與混勻：
選擇2~3個適宜稀釋度（通常10?², 10?³, 10??），取1mL樣液加入無菌平皿。
迅速倒入15~20mL VRBA，水平旋轉平皿10次混勻，避免產生氣泡。
培養(yǎng)基厚度：凝固后厚度≥4mm（過薄影響菌落特征）。
3、培養(yǎng)條件
覆蓋上層：待瓊脂凝固后，再傾注約3~5mL VRBA覆蓋表面（防止蔓延菌生長）。
溫度與時間：36±1℃倒置培養(yǎng)18~24小時，避免震動。
4、菌落計數(shù)
典型菌落特征：
紫紅色，直徑≥0.5mm。
周圍有紅色膽鹽沉淀環(huán)（核心特征）。
部分菌落可能有"金屬光澤"。
計數(shù)范圍：選擇菌落數(shù)在15~150 CFU的平板（若均＜15則選最低稀釋度）。
5、確證實驗（BGLB發(fā)酵管）
挑取疑似菌落：從VRBA平板挑取10個典型菌落（不足10個則全選），接種于煌綠乳糖膽鹽肉湯。
培養(yǎng)與判斷：36±1℃培養(yǎng)24~48小時，產氣者（導管內有氣泡） 判為大腸菌群陽性。
6、結果計算
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二、關鍵注意事項
1、培養(yǎng)基質量控制
VRBA滅菌后pH應為7.4±0.1，使用前測試靈敏度（接種大腸埃希氏菌應生長良好）。
膽鹽濃度不足會導致雜菌過度生長。
2、避免菌落蔓延
傾注雙層瓊脂（覆蓋層）是防止蔓延的關鍵。
培養(yǎng)時間勿超24小時，否則菌落可能融合。
3、稀釋誤差控制
吸樣前混勻樣液，吸管插入深度＜2.5cm，吹吸≥3次。
高油脂樣品用含Tween 80的稀釋液。
4、典型菌落識別
非典型菌落（無色、無沉淀環(huán)）不計數(shù)。
若蔓延菌覆蓋＞50%平板，應重做實驗。
5、確證實驗必要性
VRBA上部分雜菌（如變形桿菌）可能呈假陽性，BGLB發(fā)酵是金標準。
三、常見問題與解決
菌落過小/無沉淀環(huán)：培養(yǎng)基過熱或膽鹽失效。
全板蔓延：樣品含過多蔓延菌（如變形桿菌），改用VRBA-MUG法或濾膜法。
無典型菌落：可能稀釋度過高或樣品含抑菌劑（需中和處理）。
四、標準依據(jù)
中國國標：GB 4789.3-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數(shù)》
國際常用：ISO 4832:2006、FDA BAM Chapter 4
嚴格遵循上述要點可確保結果準確性，尤其在食品、飲用水安全檢測中，每一步的規(guī)范性直接影響結果可靠性。實驗后需對培養(yǎng)基121℃滅菌20分鐘再廢棄！
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