大腸菌群平板計(jì)數(shù)法的操作步驟與要點(diǎn)及常見問(wèn)題與解決！
小楊 / 2025-06-20 09:47:27
百歐博偉生物：大腸菌群平板計(jì)數(shù)法是檢測(cè)食品、水質(zhì)等樣品中大腸菌群數(shù)量的常用方法，其操作要點(diǎn)在于無(wú)菌操作、準(zhǔn)確稀釋、均勻涂布/傾注、典型菌落識(shí)別和確證實(shí)驗(yàn)。以下是詳細(xì)的操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng)：
一、 主要操作步驟與要點(diǎn)
1、樣品制備與稀釋
無(wú)菌操作：全程在超凈臺(tái)/酒精燈旁進(jìn)行，器材需121℃滅菌20分鐘。
均質(zhì)化：固體樣品按1:10（如25g樣品+225mL無(wú)菌生理鹽水）均質(zhì)，液體樣品直接稀釋。
梯度稀釋：做10倍系列稀釋（10?¹, 10?², 10?³...），每稀釋一次更換無(wú)菌吸管。
2、傾注平板
培養(yǎng)基準(zhǔn)備：結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）加熱溶解，冷卻至45~50℃（溫度過(guò)高會(huì)殺死細(xì)菌，過(guò)低則凝固）。
加樣與混勻：
選擇2~3個(gè)適宜稀釋度（通常10?², 10?³, 10??），取1mL樣液加入無(wú)菌平皿。
迅速倒入15~20mL VRBA，水平旋轉(zhuǎn)平皿10次混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
培養(yǎng)基厚度：凝固后厚度≥4mm（過(guò)薄影響菌落特征）。
3、培養(yǎng)條件
覆蓋上層：待瓊脂凝固后，再傾注約3~5mL VRBA覆蓋表面（防止蔓延菌生長(zhǎng)）。
溫度與時(shí)間：36±1℃倒置培養(yǎng)18~24小時(shí)，避免震動(dòng)。
4、菌落計(jì)數(shù)
典型菌落特征：
紫紅色，直徑≥0.5mm。
周圍有紅色膽鹽沉淀環(huán)（核心特征）。
部分菌落可能有"金屬光澤"。
計(jì)數(shù)范圍：選擇菌落數(shù)在15~150 CFU的平板（若均＜15則選最低稀釋度）。
5、確證實(shí)驗(yàn)（BGLB發(fā)酵管）
挑取疑似菌落：從VRBA平板挑取10個(gè)典型菌落（不足10個(gè)則全選），接種于煌綠乳糖膽鹽肉湯。
培養(yǎng)與判斷：36±1℃培養(yǎng)24~48小時(shí)，產(chǎn)氣者（導(dǎo)管內(nèi)有氣泡） 判為大腸菌群陽(yáng)性。
6、結(jié)果計(jì)算
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二、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
1、培養(yǎng)基質(zhì)量控制
VRBA滅菌后pH應(yīng)為7.4±0.1，使用前測(cè)試靈敏度（接種大腸埃希氏菌應(yīng)生長(zhǎng)良好）。
膽鹽濃度不足會(huì)導(dǎo)致雜菌過(guò)度生長(zhǎng)。
2、避免菌落蔓延
傾注雙層瓊脂（覆蓋層）是防止蔓延的關(guān)鍵。
培養(yǎng)時(shí)間勿超24小時(shí)，否則菌落可能融合。
3、稀釋誤差控制
吸樣前混勻樣液，吸管插入深度＜2.5cm，吹吸≥3次。
高油脂樣品用含Tween 80的稀釋液。
4、典型菌落識(shí)別
非典型菌落（無(wú)色、無(wú)沉淀環(huán)）不計(jì)數(shù)。
若蔓延菌覆蓋＞50%平板，應(yīng)重做實(shí)驗(yàn)。
5、確證實(shí)驗(yàn)必要性
VRBA上部分雜菌（如變形桿菌）可能呈假陽(yáng)性，BGLB發(fā)酵是金標(biāo)準(zhǔn)。
三、常見問(wèn)題與解決
菌落過(guò)小/無(wú)沉淀環(huán)：培養(yǎng)基過(guò)熱或膽鹽失效。
全板蔓延：樣品含過(guò)多蔓延菌（如變形桿菌），改用VRBA-MUG法或?yàn)V膜法。
無(wú)典型菌落：可能稀釋度過(guò)高或樣品含抑菌劑（需中和處理）。
四、標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)
中國(guó)國(guó)標(biāo)：GB 4789.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》
國(guó)際常用：ISO 4832:2006、FDA BAM Chapter 4
嚴(yán)格遵循上述要點(diǎn)可確保結(jié)果準(zhǔn)確性，尤其在食品、飲用水安全檢測(cè)中，每一步的規(guī)范性直接影響結(jié)果可靠性。實(shí)驗(yàn)后需對(duì)培養(yǎng)基121℃滅菌20分鐘再?gòu)U棄！
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