血平皿上對細(xì)菌進(jìn)行鑒定和計(jì)數(shù)的操作流程與注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-07-14 09:31:38
百歐博偉生物：在
血平皿上對細(xì)菌進(jìn)行鑒定和計(jì)數(shù)是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)操作，結(jié)合了菌落形態(tài)觀察、生化特性分析及計(jì)數(shù)方法，具體流程如下：
一、細(xì)菌計(jì)數(shù)（活菌計(jì)數(shù)）
血平皿計(jì)數(shù)主要采用平板菌落計(jì)數(shù)法，適用于樣品中活菌數(shù)量的定量分析（如臨床標(biāo)本中致病菌濃度、環(huán)境樣品污染程度等）。
操作步驟：
1、樣品稀釋
若樣品中菌量較高（如痰液、膿液），需先進(jìn)行梯度稀釋（通常用無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液，稀釋倍數(shù)為 10?¹、10?²……10??），確保每個(gè)平板上生長的菌落數(shù)在30-300 個(gè)（此范圍計(jì)數(shù)結(jié)果更準(zhǔn)確）。
2、接種與培養(yǎng)
取不同稀釋度的樣品（通常 0.1-0.2 mL），均勻涂布于血平皿表面，或采用傾注法（樣品與冷卻的培養(yǎng)基混合后傾注平板）。
培養(yǎng)條件：35-37℃，需氧或厭氧環(huán)境（根據(jù)目標(biāo)菌特性，如鏈球菌需 5% CO?環(huán)境），培養(yǎng) 18-24 小時(shí)（苛養(yǎng)菌可能需 48 小時(shí)）。
3、計(jì)數(shù)計(jì)算
選擇菌落數(shù)在 30-300 個(gè)的平板，統(tǒng)計(jì)總菌落數(shù)，按以下公式計(jì)算：
每克（或每毫升）樣品活菌數(shù) = 平板菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù) ÷ 接種體積
例：10??稀釋度的樣品接種 0.1 mL，平板上有 50 個(gè)菌落，則活菌數(shù) = 50 × 10? ÷ 0.1 = 5×10? CFU/mL（CFU：菌落形成單位）。
二、細(xì)菌鑒定（結(jié)合形態(tài)與生化特性）
血平皿上的細(xì)菌鑒定需通過菌落形態(tài)觀察、溶血特性分析、生化反應(yīng)及分子生物學(xué)方法逐步確認(rèn)，具體步驟如下：
1、初步觀察：菌落形態(tài)與溶血特性
菌落形態(tài)：記錄菌落的大小（直徑）、形狀（圓形、不規(guī)則）、邊緣（整齊、鋸齒狀）、表面（光滑、粗糙）、顏色（白色、黃色、灰色）、透明度（透明、半透明、不透明）、凸起程度（扁平、隆起）等。
例：
金黃色葡萄球菌菌落通常為圓形、光滑、凸起、金黃色；肺炎鏈球菌菌落較小、扁平、邊緣呈 “臍狀”（培養(yǎng) 48 小時(shí)后中央凹陷）。
溶血特性：根據(jù)血平皿上的溶血環(huán)類型（α、β、γ 溶血，見前文）初步縮小范圍。
例：β- 溶血的革蘭陽性球菌可能為 A 群鏈球菌或
金黃色葡萄球菌；α- 溶血的革蘭陽性球菌可能為肺炎鏈球菌。
2、染色與顯微鏡觀察
挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色，通過細(xì)菌的染色性（革蘭陽性 / 陰性）、形態(tài)（球菌 / 桿菌）、排列方式（鏈狀、葡萄狀、成對）進(jìn)一步鑒定。
例：
革蘭陽性球菌，呈葡萄狀排列 → 疑似葡萄球菌屬；
革蘭陽性球菌，呈鏈狀排列，β- 溶血 → 疑似鏈球菌屬。
3、生化反應(yīng)與特異性試驗(yàn)
根據(jù)初步判斷的菌屬，選擇針對性生化試驗(yàn)確認(rèn)菌種：
葡萄球菌屬鑒定：
凝固酶試驗(yàn)：金黃色葡萄球菌凝固酶陽性，表皮葡萄球菌陰性；
甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：
金黃色葡萄球菌可發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸，其他葡萄球菌多為陰性。
鏈球菌屬鑒定：
桿菌肽敏感試驗(yàn)：A 群鏈球菌對桿菌肽敏感（抑菌環(huán)≥10 mm），其他 β- 溶血鏈球菌多耐藥；
奧普托欣試驗(yàn)：
肺炎鏈球菌敏感（抑菌環(huán)≥14 mm），其他 α- 溶血鏈球菌耐藥。
腸球菌屬：
耐鹽試驗(yàn)（6.5% NaCl 培養(yǎng)基生長）和膽汁七葉苷試驗(yàn)陽性，可與其他鏈球菌區(qū)分。
4、分子生物學(xué)與自動(dòng)化鑒定（進(jìn)階方法）
PCR 技術(shù)：通過擴(kuò)增特異性基因（如葡萄球菌的 nuc 基因、鏈球菌的 16S rRNA 基因）快速鑒定。
質(zhì)譜分析：通過細(xì)菌蛋白質(zhì)圖譜與數(shù)據(jù)庫比對，實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的種水平鑒定，適用于復(fù)雜或罕見菌株。
自動(dòng)化鑒定系統(tǒng)：通過預(yù)制生化反應(yīng)板，結(jié)合儀器讀數(shù)判斷菌種。
三、注意事項(xiàng)
純培養(yǎng)優(yōu)先：鑒定前需通過劃線分離獲得單個(gè)菌落，避免雜菌干擾。
培養(yǎng)條件匹配：部分細(xì)菌需特殊環(huán)境，否則可能不生長或溶血特性異常（如
肺炎鏈球菌在厭氧環(huán)境下可呈 β- 溶血）。
結(jié)果綜合判斷：單一試驗(yàn)可能存在交叉反應(yīng)（如某些凝固酶陰性葡萄球菌也可能發(fā)酵甘露醇），需結(jié)合菌落形態(tài)、染色結(jié)果及多項(xiàng)生化試驗(yàn)綜合判定。
通過以上步驟，可從
血平皿上的細(xì)菌菌落中實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確計(jì)數(shù)和菌種鑒定，為臨床診斷、微生物研究提供關(guān)鍵依據(jù)。
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