逐步遞增法：建立人乳腺癌他莫昔芬耐藥細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)步驟！
小楊 / 2025-07-15 09:24:52
建立
人乳腺癌他莫昔芬耐藥細(xì)胞株是模擬臨床耐藥過(guò)程、研究耐藥機(jī)制的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，常用方法為逐步遞增藥物濃度誘導(dǎo)法（更接近臨床漸進(jìn)性耐藥特征）和高濃度藥物沖擊法（適用于快速獲得耐藥克?。Ｒ韵乱宰畛Ｓ玫?“逐步遞增法” 為例，詳細(xì)說(shuō)明實(shí)驗(yàn)步驟及關(guān)鍵要點(diǎn)：
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
1、核心材料與試劑
親代細(xì)胞株：選擇 ER 陽(yáng)性（ER?）乳腺癌細(xì)胞，需確保細(xì)胞狀態(tài)良好（活力＞90%，無(wú)支原體污染），且對(duì)他莫昔芬敏感（預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)親代細(xì)胞的 IC??，作為耐藥判定基準(zhǔn)）。
藥物：他莫昔芬，用無(wú)水乙醇或 DMSO 溶解（DMSO 終濃度需＜0.1%，避免細(xì)胞毒性），配制成 100mM 儲(chǔ)存液，-20℃避光保存（分裝避免反復(fù)凍融）。
培養(yǎng)基：DMEM 或 RPMI-1640（含 10% 胎牛血清 FBS、1% 雙抗（青霉素 + 鏈霉素）），根據(jù)親代細(xì)胞需求選擇。
試劑與儀器：細(xì)胞培養(yǎng)瓶、離心管、胰酶（0.25%）、PBS試劑盒、倒置顯微鏡、CO?培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀等。
2、預(yù)實(shí)驗(yàn)：確定初始誘導(dǎo)濃度
通過(guò) MTT 法檢測(cè)親代細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的敏感性，計(jì)算 IC??（抑制 50% 細(xì)胞增殖的藥物濃度）。初始誘導(dǎo)濃度通常設(shè)為親代細(xì)胞 IC??的 1/10~1/5（例如：若
MCF-7 的 IC??為 0.5μM，則初始濃度可設(shè)為 0.05~0.1μM）。
二、逐步遞增藥物濃度誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞
1、初始適應(yīng)階段（第 1-4 周）
接種細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親代細(xì)胞，以 5×10? cells/mL 密度接種于 6 孔板或 25cm² 培養(yǎng)瓶，加入含初始濃度他莫昔芬的完全培養(yǎng)基（對(duì)照組為含同等濃度溶劑（DMSO / 乙醇）的培養(yǎng)基）。
培養(yǎng)與觀察：置于 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞形態(tài)（如是否出現(xiàn)皺縮、脫落）和生長(zhǎng)速度。若細(xì)胞存活＞50%，每 3-4 天換液 1 次（維持藥物濃度穩(wěn)定）；若細(xì)胞大量死亡（存活＜30%），可降低藥物濃度至初始濃度的 1/2，待細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)后再調(diào)回原濃度。
傳代：當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá) 70%-80% 時(shí)，用胰酶消化傳代（傳代比例 1:2~1:3），傳代后仍加入相同濃度的他莫昔芬，確保藥物持續(xù)作用。
2、藥物濃度遞增階段（第 5 周至穩(wěn)定耐藥）
當(dāng)細(xì)胞在初始濃度下可穩(wěn)定生長(zhǎng)（融合度達(dá) 70% 以上，傳代 3 次以上無(wú)明顯生長(zhǎng)抑制），開(kāi)始逐步提高他莫昔芬濃度，每次遞增幅度為當(dāng)前濃度的 20%-50%（例如：從0.1μM→0.15μM→0.2μM→…），具體步驟：
濃度調(diào)整：每輪遞增后，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)：若 3-5 天內(nèi)細(xì)胞可貼壁并增殖（存活＞60%），繼續(xù)培養(yǎng)并傳代；若生長(zhǎng)停滯或大量死亡，維持當(dāng)前濃度直至細(xì)胞適應(yīng)（可能需 1-2 周），再嘗試遞增。
關(guān)鍵指標(biāo)：每次傳代時(shí)，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)估生長(zhǎng)速率（與對(duì)照組對(duì)比），確保耐藥細(xì)胞在藥物存在下仍能保持增殖能力（生長(zhǎng)速率不低于對(duì)照組的 50%）。
3、穩(wěn)定耐藥株篩選（誘導(dǎo)終點(diǎn)）
當(dāng)細(xì)胞能在10 倍以上親代 IC??濃度的他莫昔芬中穩(wěn)定生長(zhǎng)（連續(xù)傳代 5 次以上，生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)明顯抑制），即可終止誘導(dǎo)，標(biāo)記為 “候選耐藥細(xì)胞株”。
三、耐藥性驗(yàn)證（核心步驟）
需通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的敏感性顯著降低，確保耐藥表型穩(wěn)定：
1、藥敏實(shí)驗(yàn)（IC??測(cè)定）
方法：MTT 法或 CCK-8 法。將候選耐藥細(xì)胞與親代細(xì)胞分別接種于 96 孔板（5×10³ cells / 孔），加入梯度濃度他莫昔芬（0.01-100μM），培養(yǎng) 48-72h 后檢測(cè)吸光度，計(jì)算 IC??。
判定標(biāo)準(zhǔn)：耐藥細(xì)胞的 IC??需≥親代細(xì)胞 IC??的 10 倍，且重復(fù) 3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
2、增殖能力驗(yàn)證
平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：將耐藥細(xì)胞與親代細(xì)胞以 500 cells / 孔接種于 6 孔板，加入 10 倍 IC??濃度的他莫昔芬，培養(yǎng) 10-14 天，結(jié)晶紫染色后計(jì)數(shù)克隆數(shù)（＞50 個(gè)細(xì)胞的克隆為有效克?。Ｄ退幖?xì)胞的克隆形成率應(yīng)顯著高于親代細(xì)胞（通常≥親代的 3 倍）。
四、耐藥細(xì)胞株鑒定（確保表型與機(jī)制穩(wěn)定性）
1、關(guān)鍵分子表型檢測(cè)
ER 表達(dá)驗(yàn)證：通過(guò) Western blot 或免疫熒光檢測(cè) ERα 蛋白表達(dá)（他莫昔芬耐藥株多保留 ER 表達(dá)，部分可能下調(diào)），排除因 ER 缺失導(dǎo)致的 “非特異性耐藥”。
耐藥相關(guān)通路檢測(cè)：檢測(cè)常見(jiàn)耐藥通路分子的表達(dá)或磷酸化水平，確認(rèn)耐藥機(jī)制。
2、穩(wěn)定性測(cè)試
將耐藥細(xì)胞在無(wú)他莫昔芬的培養(yǎng)基中傳代 5-10 次后，再次檢測(cè) IC??，若仍保持耐藥性（IC??無(wú)明顯下降），說(shuō)明耐藥表型穩(wěn)定，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
五、細(xì)胞保種與傳代
保種：對(duì)穩(wěn)定耐藥株，用含 10% DMSO 的完全培養(yǎng)基凍存（梯度降溫：4℃ 30min→-20℃ 2h→-80℃過(guò)夜→液氮長(zhǎng)期保存），每代保種 3-5 支，避免傳代過(guò)度導(dǎo)致表型漂移。
傳代：常規(guī)傳代時(shí)需維持含他莫昔芬的培養(yǎng)基（濃度為最終誘導(dǎo)濃度的 1/2~1/3），避免耐藥表型丟失。
六、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
避免污染：誘導(dǎo)過(guò)程長(zhǎng)達(dá) 3-6 個(gè)月，需嚴(yán)格無(wú)菌操作，定期檢測(cè)支原體，污染會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。
藥物濃度控制：他莫昔芬易氧化，需避光保存，培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用；DMSO 濃度需＜0.1%（過(guò)高會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，干擾結(jié)果）。
細(xì)胞狀態(tài)優(yōu)先：若細(xì)胞在某一濃度下長(zhǎng)期生長(zhǎng)停滯（＞2 周），需降低濃度 “復(fù)蘇”，避免細(xì)胞全死亡；誘導(dǎo)初期細(xì)胞可能出現(xiàn)形態(tài)改變，屬正常適應(yīng)過(guò)程。
平行對(duì)照：全程保留親代細(xì)胞（同條件培養(yǎng)），作為耐藥性對(duì)比的基準(zhǔn)。
通過(guò)以上步驟，可獲得穩(wěn)定的他莫昔芬耐藥細(xì)胞株，為后續(xù)耐藥機(jī)制研究提供可靠模型。
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