逐步遞增法：建立人乳腺癌他莫昔芬耐藥細(xì)胞株的實驗步驟！
小楊 / 2025-07-15 09:24:52
建立
人乳腺癌他莫昔芬耐藥細(xì)胞株是模擬臨床耐藥過程、研究耐藥機制的基礎(chǔ)實驗，常用方法為逐步遞增藥物濃度誘導(dǎo)法（更接近臨床漸進性耐藥特征）和高濃度藥物沖擊法（適用于快速獲得耐藥克?。?。以下以最常用的 “逐步遞增法” 為例，詳細(xì)說明實驗步驟及關(guān)鍵要點：
一、實驗前準(zhǔn)備
1、核心材料與試劑
親代細(xì)胞株：選擇 ER 陽性（ER?）乳腺癌細(xì)胞，需確保細(xì)胞狀態(tài)良好（活力＞90%，無支原體污染），且對他莫昔芬敏感（預(yù)實驗檢測親代細(xì)胞的 IC??，作為耐藥判定基準(zhǔn)）。
藥物：他莫昔芬，用無水乙醇或 DMSO 溶解（DMSO 終濃度需＜0.1%，避免細(xì)胞毒性），配制成 100mM 儲存液，-20℃避光保存（分裝避免反復(fù)凍融）。
培養(yǎng)基：DMEM 或 RPMI-1640（含 10% 胎牛血清 FBS、1% 雙抗（青霉素 + 鏈霉素）），根據(jù)親代細(xì)胞需求選擇。
試劑與儀器：細(xì)胞培養(yǎng)瓶、離心管、胰酶（0.25%）、PBS試劑盒、倒置顯微鏡、CO?培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀等。
2、預(yù)實驗：確定初始誘導(dǎo)濃度
通過 MTT 法檢測親代細(xì)胞對他莫昔芬的敏感性，計算 IC??（抑制 50% 細(xì)胞增殖的藥物濃度）。初始誘導(dǎo)濃度通常設(shè)為親代細(xì)胞 IC??的 1/10~1/5（例如：若
MCF-7 的 IC??為 0.5μM，則初始濃度可設(shè)為 0.05~0.1μM）。
二、逐步遞增藥物濃度誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞
1、初始適應(yīng)階段（第 1-4 周）
接種細(xì)胞：取對數(shù)生長期的親代細(xì)胞，以 5×10? cells/mL 密度接種于 6 孔板或 25cm² 培養(yǎng)瓶，加入含初始濃度他莫昔芬的完全培養(yǎng)基（對照組為含同等濃度溶劑（DMSO / 乙醇）的培養(yǎng)基）。
培養(yǎng)與觀察：置于 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞形態(tài)（如是否出現(xiàn)皺縮、脫落）和生長速度。若細(xì)胞存活＞50%，每 3-4 天換液 1 次（維持藥物濃度穩(wěn)定）；若細(xì)胞大量死亡（存活＜30%），可降低藥物濃度至初始濃度的 1/2，待細(xì)胞恢復(fù)生長后再調(diào)回原濃度。
傳代：當(dāng)細(xì)胞融合度達 70%-80% 時，用胰酶消化傳代（傳代比例 1:2~1:3），傳代后仍加入相同濃度的他莫昔芬，確保藥物持續(xù)作用。
2、藥物濃度遞增階段（第 5 周至穩(wěn)定耐藥）
當(dāng)細(xì)胞在初始濃度下可穩(wěn)定生長（融合度達 70% 以上，傳代 3 次以上無明顯生長抑制），開始逐步提高他莫昔芬濃度，每次遞增幅度為當(dāng)前濃度的 20%-50%（例如：從0.1μM→0.15μM→0.2μM→…），具體步驟：
濃度調(diào)整：每輪遞增后，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)：若 3-5 天內(nèi)細(xì)胞可貼壁并增殖（存活＞60%），繼續(xù)培養(yǎng)并傳代；若生長停滯或大量死亡，維持當(dāng)前濃度直至細(xì)胞適應(yīng)（可能需 1-2 周），再嘗試遞增。
關(guān)鍵指標(biāo)：每次傳代時，通過細(xì)胞計數(shù)評估生長速率（與對照組對比），確保耐藥細(xì)胞在藥物存在下仍能保持增殖能力（生長速率不低于對照組的 50%）。
3、穩(wěn)定耐藥株篩選（誘導(dǎo)終點）
當(dāng)細(xì)胞能在10 倍以上親代 IC??濃度的他莫昔芬中穩(wěn)定生長（連續(xù)傳代 5 次以上，生長狀態(tài)無明顯抑制），即可終止誘導(dǎo)，標(biāo)記為 “候選耐藥細(xì)胞株”。
三、耐藥性驗證（核心步驟）
需通過實驗證明細(xì)胞對他莫昔芬的敏感性顯著降低，確保耐藥表型穩(wěn)定：
1、藥敏實驗（IC??測定）
方法：MTT 法或 CCK-8 法。將候選耐藥細(xì)胞與親代細(xì)胞分別接種于 96 孔板（5×10³ cells / 孔），加入梯度濃度他莫昔芬（0.01-100μM），培養(yǎng) 48-72h 后檢測吸光度，計算 IC??。
判定標(biāo)準(zhǔn)：耐藥細(xì)胞的 IC??需≥親代細(xì)胞 IC??的 10 倍，且重復(fù) 3 次實驗結(jié)果一致。
2、增殖能力驗證
平板克隆形成實驗：將耐藥細(xì)胞與親代細(xì)胞以 500 cells / 孔接種于 6 孔板，加入 10 倍 IC??濃度的他莫昔芬，培養(yǎng) 10-14 天，結(jié)晶紫染色后計數(shù)克隆數(shù)（＞50 個細(xì)胞的克隆為有效克?。?。耐藥細(xì)胞的克隆形成率應(yīng)顯著高于親代細(xì)胞（通常≥親代的 3 倍）。
四、耐藥細(xì)胞株鑒定（確保表型與機制穩(wěn)定性）
1、關(guān)鍵分子表型檢測
ER 表達驗證：通過 Western blot 或免疫熒光檢測 ERα 蛋白表達（他莫昔芬耐藥株多保留 ER 表達，部分可能下調(diào)），排除因 ER 缺失導(dǎo)致的 “非特異性耐藥”。
耐藥相關(guān)通路檢測：檢測常見耐藥通路分子的表達或磷酸化水平，確認(rèn)耐藥機制。
2、穩(wěn)定性測試
將耐藥細(xì)胞在無他莫昔芬的培養(yǎng)基中傳代 5-10 次后，再次檢測 IC??，若仍保持耐藥性（IC??無明顯下降），說明耐藥表型穩(wěn)定，可用于后續(xù)實驗。
五、細(xì)胞保種與傳代
保種：對穩(wěn)定耐藥株，用含 10% DMSO 的完全培養(yǎng)基凍存（梯度降溫：4℃ 30min→-20℃ 2h→-80℃過夜→液氮長期保存），每代保種 3-5 支，避免傳代過度導(dǎo)致表型漂移。
傳代：常規(guī)傳代時需維持含他莫昔芬的培養(yǎng)基（濃度為最終誘導(dǎo)濃度的 1/2~1/3），避免耐藥表型丟失。
六、關(guān)鍵注意事項
避免污染：誘導(dǎo)過程長達 3-6 個月，需嚴(yán)格無菌操作，定期檢測支原體，污染會導(dǎo)致實驗失敗。
藥物濃度控制：他莫昔芬易氧化，需避光保存，培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用；DMSO 濃度需＜0.1%（過高會抑制細(xì)胞生長，干擾結(jié)果）。
細(xì)胞狀態(tài)優(yōu)先：若細(xì)胞在某一濃度下長期生長停滯（＞2 周），需降低濃度 “復(fù)蘇”，避免細(xì)胞全死亡；誘導(dǎo)初期細(xì)胞可能出現(xiàn)形態(tài)改變，屬正常適應(yīng)過程。
平行對照：全程保留親代細(xì)胞（同條件培養(yǎng)），作為耐藥性對比的基準(zhǔn)。
通過以上步驟，可獲得穩(wěn)定的他莫昔芬耐藥細(xì)胞株，為后續(xù)耐藥機制研究提供可靠模型。
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