培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌失敗的常見(jiàn)原因分析及其應(yīng)對(duì)方法！
小楊 / 2025-07-28 09:49:33
百歐博偉生物：高壓蒸汽滅菌是培養(yǎng)基滅菌最常用的方法，其原理是通過(guò) 121℃（103.4kPa）下維持 15-30 分鐘（根據(jù)培養(yǎng)基體積調(diào)整），利用飽和蒸汽的高溫殺滅包括芽孢在內(nèi)的所有微生物。滅菌失敗會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基污染，直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以下從設(shè)備、操作、培養(yǎng)基自身三個(gè)維度分析常見(jiàn)失敗原因及應(yīng)對(duì)方法：
一、滅菌設(shè)備相關(guān)原因
滅菌器的性能和狀態(tài)是滅菌成功的基礎(chǔ)，設(shè)備故障或參數(shù)異常是常見(jiàn)誘因。
1、滅菌器壓力 / 溫度未達(dá)標(biāo)
表現(xiàn)：滅菌過(guò)程中顯示壓力正常，但實(shí)際溫度未達(dá)到 121℃（如僅 115℃），導(dǎo)致芽孢未被殺滅。
原因：
滅菌器內(nèi)非飽和蒸汽過(guò)多（蒸汽中含大量冷凝水，或蒸汽發(fā)生器水位過(guò)高，蒸汽含水量超標(biāo)），飽和蒸汽比例不足會(huì)降低滅菌溫度（相同壓力下，飽和蒸汽溫度高于濕蒸汽）。
壓力表或溫度傳感器校準(zhǔn)失效（長(zhǎng)期未校準(zhǔn)，顯示值與實(shí)際值偏差）。
滅菌器密封不良（如密封圈老化），導(dǎo)致蒸汽泄漏，壓力無(wú)法維持。
應(yīng)對(duì)：
滅菌前檢查蒸汽發(fā)生器水位（避免過(guò)高或過(guò)低），確保蒸汽干燥度（可通過(guò)排放冷空氣時(shí)觀察，排出的蒸汽應(yīng)呈“直線狀”而非“霧狀”）。
定期校準(zhǔn)壓力表和溫度傳感器（建議每年至少 1 次）。
每次使用前檢查密封圈是否完好，若老化、變形需及時(shí)更換。
2、冷空氣未徹底排盡
表現(xiàn)：滅菌器內(nèi)存在冷空氣團(tuán)，局部溫度低于設(shè)定值（如冷空氣聚集處溫度僅 100℃左右），形成“滅菌死角”。
原因：
未按規(guī)程排放冷空氣（如手動(dòng)排氣時(shí)時(shí)間不足，或自動(dòng)排氣功能故障）。
培養(yǎng)基容器擺放過(guò)密，遮擋排氣口，冷空氣無(wú)法順利排出。
應(yīng)對(duì)：
手動(dòng)排氣：滅菌開(kāi)始后，先打開(kāi)排氣閥，待有大量蒸汽持續(xù)排出（約 3-5 分鐘），確認(rèn)冷空氣排盡后再關(guān)閉。
自動(dòng)排氣滅菌器：需檢查排氣閥是否通暢，避免被雜質(zhì)堵塞。
擺放規(guī)范：容器間留空隙，瓶口朝向一致（避免蒸汽流通受阻），液體培養(yǎng)基瓶裝量不超過(guò)容器容積的 80%（防止沸騰時(shí)液體溢出堵塞排氣）。
3、滅菌時(shí)間不足
表現(xiàn)：滅菌時(shí)長(zhǎng)未達(dá)到要求（如大容量培養(yǎng)基僅滅菌 15 分鐘），微生物未被完全殺滅。
原因：
未根據(jù)培養(yǎng)基體積調(diào)整時(shí)間（如 500mL 瓶裝培養(yǎng)基需滅菌 30 分鐘，若按小體積 15 分鐘設(shè)定則時(shí)間不足）。
滅菌器計(jì)時(shí)錯(cuò)誤（如從開(kāi)始加熱時(shí)計(jì)時(shí)，而非達(dá)到 121℃后計(jì)時(shí)）。
應(yīng)對(duì)：
明確計(jì)時(shí)起點(diǎn)：從滅菌器溫度達(dá)到 121℃、壓力穩(wěn)定后開(kāi)始計(jì)時(shí)。
按體積調(diào)整時(shí)間：一般 200mL 以下滅菌 15-20 分鐘，200-500mL 滅菌 20-30 分鐘，1000mL 以上需 30-40 分鐘。
二、操作流程相關(guān)原因
操作不規(guī)范會(huì)導(dǎo)致滅菌過(guò)程“形式達(dá)標(biāo)但實(shí)際失效”，是人為失誤的主要來(lái)源。
1、培養(yǎng)基分裝或容器滅菌不當(dāng)
表現(xiàn)：滅菌后培養(yǎng)基污染，污染菌多為環(huán)境中的雜菌（如
芽孢桿菌、
霉菌）。
原因：
分裝時(shí)容器未滅菌（如培養(yǎng)皿、試管未提前滅菌，或滅菌后接觸非無(wú)菌臺(tái)面）。
瓶口 / 管口密封不嚴(yán)（如棉塞松動(dòng)、瓶蓋未擰緊），滅菌時(shí)蒸汽無(wú)法進(jìn)入，或滅菌后空氣進(jìn)入時(shí)帶入雜菌。
分裝過(guò)程中液體灑出瓶口，未清潔即滅菌，殘留的有機(jī)物在滅菌后成為雜菌滋生的營(yíng)養(yǎng)源。
應(yīng)對(duì)：
容器需提前滅菌（如培養(yǎng)皿、試管需單獨(dú)滅菌后再分裝，或分裝后整體滅菌時(shí)確保容器無(wú)菌）。
密封規(guī)范：棉塞需松緊適宜（既能透氣又能防污染），玻璃瓶需用螺旋蓋（滅菌時(shí)稍松，避免高壓下炸裂；滅菌后趁熱擰緊）。
分裝后清潔瓶口：用無(wú)菌紗布擦拭殘留液體，避免有機(jī)物殘留。
2、滅菌后處理不當(dāng)導(dǎo)致二次污染
表現(xiàn)：滅菌過(guò)程合格，但后續(xù)操作中引入雜菌（如滅菌后開(kāi)蓋冷卻，或取出時(shí)接觸非無(wú)菌環(huán)境）。
原因：
滅菌結(jié)束后，未等壓力降至“0”即打開(kāi)滅菌器（內(nèi)外壓力差導(dǎo)致外界空氣涌入，帶入雜菌）。
取出培養(yǎng)基時(shí)，容器外壁接觸滅菌器內(nèi)非無(wú)菌區(qū)域（如滅菌器底部積水、未清潔的內(nèi)壁）。
冷卻環(huán)境不潔（如在普通臺(tái)面冷卻，而非超凈工作臺(tái)或無(wú)菌室）。
應(yīng)對(duì)：
滅菌后需等待壓力自然降至 0，確認(rèn)無(wú)蒸汽噴出后再打開(kāi)蓋子，避免“暴沸”和空氣倒灌。
滅菌器定期清潔：每次使用后傾倒底部積水，每周用中性清潔劑擦拭內(nèi)壁，防止水垢和雜菌殘留。
冷卻環(huán)節(jié)：在超凈工作臺(tái)內(nèi)或無(wú)菌環(huán)境中冷卻，容器外壁可用 75% 酒精消毒后再取出。
三、培養(yǎng)基自身相關(guān)原因
培養(yǎng)基的成分或狀態(tài)可能影響滅菌效果，尤其對(duì)含特殊成分的培養(yǎng)基需特別注意。
1、培養(yǎng)基成分抑制滅菌效果
表現(xiàn)：含大量有機(jī)物或顆粒的培養(yǎng)基（如含血清、淀粉的培養(yǎng)基）滅菌后仍有雜菌。
原因：
高濃度有機(jī)物（如血清、油脂）會(huì)包裹微生物，形成“保護(hù)屏障”，蒸汽難以穿透，導(dǎo)致滅菌不徹底。
顆粒狀成分（如淀粉顆粒、活性炭）內(nèi)部可能藏匿微生物，滅菌溫度無(wú)法滲透至顆粒核心。
應(yīng)對(duì)：
含血清、酶等熱敏成分的培養(yǎng)基：需采用“過(guò)濾滅菌”（0.22μm 濾膜），而非高壓蒸汽滅菌（高溫會(huì)破壞成分）。
含顆粒的培養(yǎng)基：滅菌前充分?jǐn)嚢?，確保顆粒分散；延長(zhǎng)滅菌時(shí)間（如比常規(guī)增加 10-15 分鐘），或先溶解顆粒后再滅菌。
2、培養(yǎng)基 pH 值異常
表現(xiàn)：過(guò)酸或過(guò)堿的培養(yǎng)基滅菌后易污染，或因高溫導(dǎo)致成分分解，間接影響滅菌效果。
原因：
pH 過(guò)低（<5.0）或過(guò)高（>8.0）時(shí)，培養(yǎng)基成分（如碳水化合物）在高溫下易分解，產(chǎn)生酸性或堿性物質(zhì)，改變滅菌環(huán)境，影響微生物殺滅效果。
過(guò)酸環(huán)境可能導(dǎo)致容器（如玻璃試管）腐蝕，產(chǎn)生雜質(zhì)污染。
應(yīng)對(duì)：
滅菌前調(diào)整 pH 至適宜范圍（多數(shù)培養(yǎng)基 pH 為 7.0-7.4），用 pH 計(jì)或精密試紙檢測(cè)。
對(duì)過(guò)酸 / 過(guò)堿的培養(yǎng)基，可先中和至中性再滅菌，避免成分分解。
四、滅菌失敗的判斷與處理
若懷疑滅菌失敗，可通過(guò)以下方法驗(yàn)證：
無(wú)菌檢驗(yàn)：取少量滅菌后的培養(yǎng)基，在 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24-48 小時(shí)，觀察是否有菌落生長(zhǎng)（固體培養(yǎng)基）或渾濁（液體培養(yǎng)基）。
陽(yáng)性對(duì)照：在滅菌后的培養(yǎng)基中加入已知芽孢菌（如
枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢），培養(yǎng)后若有生長(zhǎng)，說(shuō)明滅菌失敗。
處理方式：滅菌失敗的培養(yǎng)基需重新滅菌（若未污染）或直接廢棄（已污染），不可用于實(shí)驗(yàn)；同時(shí)排查上述原因，解決問(wèn)題后再進(jìn)行下一次滅菌。
五、總結(jié)
高壓蒸汽滅菌失敗的核心原因可歸納為“設(shè)備不達(dá)標(biāo)、操作不規(guī)范、培養(yǎng)基不適配”。解決關(guān)鍵在于：
確保滅菌器壓力、溫度、時(shí)間參數(shù)準(zhǔn)確，冷空氣徹底排出；
規(guī)范分裝、擺放和滅菌后處理，避免二次污染；
根據(jù)培養(yǎng)基類(lèi)型（成分、體積）調(diào)整滅菌方案。
通過(guò)嚴(yán)格控制每一步驟，可顯著降低滅菌失敗風(fēng)險(xiǎn)，保證培養(yǎng)基的無(wú)菌性。
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