游離生物素測(cè)定培養(yǎng)基配制過(guò)程中無(wú)菌化處理的操作要點(diǎn)！
小楊 / 2025-08-12 09:52:01
百歐博偉生物：在
游離生物素測(cè)定培養(yǎng)基的配制中，無(wú)菌化處理是核心環(huán)節(jié)之一，直接影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性（避免雜菌污染導(dǎo)致的“假陽(yáng)性生長(zhǎng)”）。以下是無(wú)菌化處理的關(guān)鍵操作要點(diǎn)，涵蓋器具滅菌、原料除菌、操作環(huán)境控制等全流程：
一、器具與容器的無(wú)菌化處理
1、玻璃器皿的滅菌
清洗要求：先用自來(lái)水 + 洗潔精去除油污和雜質(zhì)，再用蒸餾水沖洗 3 次（避免殘留洗滌劑抑制微生物生長(zhǎng)），倒置瀝干水分。
滅菌方式：采用干熱滅菌（160-170℃，2-3 小時(shí)），適用于試管、錐形瓶、培養(yǎng)皿、移液管等。
注意：滅菌后需待烘箱自然冷卻至 60℃以下再取出（避免驟冷導(dǎo)致玻璃器皿炸裂），放入無(wú)菌操作臺(tái)備用。
替代方案：對(duì)不耐干熱的塑料容器（如一次性培養(yǎng)皿、離心管），采用高壓蒸汽滅菌（121℃，15 分鐘），但需確認(rèn)材質(zhì)耐高溫高壓。
2、橡膠/硅膠制品的滅菌
如膠塞、硅膠管等，需先用蒸餾水煮沸 10 分鐘去除表面雜質(zhì)，再與玻璃器皿一同高壓蒸汽滅菌（121℃，15 分鐘），避免干熱滅菌導(dǎo)致老化。
二、培養(yǎng)基成分的無(wú)菌化處理（分兩類(lèi)）
（一）耐高溫成分：高壓蒸汽滅菌
適用于葡萄糖、磷酸鹽、無(wú)機(jī)鹽等熱穩(wěn)定性強(qiáng)的成分（已混合成基礎(chǔ)溶液）。
操作要點(diǎn)：
分裝時(shí)，錐形瓶?jī)?nèi)溶液體積不超過(guò)瓶容積的 2/3（避免滅菌時(shí)溢出），瓶口用紗布 + 牛皮紙包扎（透氣且防污染）。
滅菌參數(shù)：121℃，15 分鐘（溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)破壞葡萄糖的還原性，或?qū)е铝姿猁}沉淀）。
排氣要求：滅菌鍋需先排盡冷空氣（冷空氣殘留會(huì)導(dǎo)致溫度不達(dá)設(shè)定值），可通過(guò)“放氣閥”先快速排氣 3-5 分鐘，再關(guān)閉閥門(mén)升壓。
冷卻處理：滅菌結(jié)束后，緩慢降壓（避免降壓過(guò)快導(dǎo)致溶液暴沸），待壓力歸零后打開(kāi)鍋蓋，取出后置于無(wú)菌操作臺(tái)附近，自然冷卻至 45-50℃（避免溫度過(guò)高破壞后續(xù)添加的熱敏成分）。
（二）熱敏性成分：過(guò)濾除菌
適用于維生素混合液（含硫胺素、核黃素等易被高溫破壞的成分）、去生物素后的酪蛋白水解物（若預(yù)處理后濃度低、易降解）等。
操作要點(diǎn)：
濾膜選擇：使用0.22 μm 孔徑的混合纖維素酯膜或聚醚砜膜（可截留細(xì)菌、真菌等微生物，且耐水相溶液）。
過(guò)濾裝置滅菌：將濾膜、濾杯、接收瓶組裝后，先高壓蒸汽滅菌（121℃，15 分鐘），冷卻后在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)安裝（戴無(wú)菌手套，避免手接觸濾膜表面）。
過(guò)濾操作：
先將待除菌溶液倒入濾杯，打開(kāi)真空泵，緩慢抽濾（避免流速過(guò)快導(dǎo)致濾膜破裂）。
若溶液黏稠（如維生素混合液），可先稀釋后過(guò)濾，或分多次過(guò)濾。
保存：除菌后的溶液需立即加入冷卻至 45-50℃的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（避免長(zhǎng)時(shí)間放置滋生污染），且全程在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)操作。
三、無(wú)菌操作環(huán)境的控制
1、超凈工作臺(tái)的使用
提前 30 分鐘開(kāi)啟紫外燈消毒（波長(zhǎng) 254 nm，可殺滅表面微生物），同時(shí)打開(kāi)風(fēng)機(jī)通風(fēng)（避免紫外殘留對(duì)操作者的傷害）。
操作前，用 75% 酒精擦拭臺(tái)面、雙手及試劑瓶外壁（75% 酒精殺菌效果最佳，過(guò)高濃度會(huì)形成蛋白凝固層，影響滲透）。
避免在操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行劇烈操作（如快速晃動(dòng)、開(kāi)關(guān)瓶塞），減少空氣對(duì)流導(dǎo)致的雜菌飄落。
2、人員操作規(guī)范
穿無(wú)菌實(shí)驗(yàn)服、戴無(wú)菌手套和口罩（頭發(fā)、口鼻是主要污染源），手套若接觸非無(wú)菌區(qū)域需立即更換。
開(kāi)蓋時(shí)，瓶塞/瓶蓋需倒扣在臺(tái)面（避免內(nèi)表面接觸污染），操作完成后立即蓋緊。
移液時(shí)，移液管尖端避免觸碰瓶口、臺(tái)面或其他非無(wú)菌物體，多余溶液不可倒回原瓶。
四、滅菌效果的驗(yàn)證
1、空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)
取少量滅菌后的培養(yǎng)基（未接種指示菌），在 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24-48 小時(shí)，觀(guān)察是否有菌落生長(zhǎng)或溶液渾濁。
若無(wú)菌生長(zhǎng)，說(shuō)明滅菌合格；若有污染，需重新排查滅菌參數(shù)、操作過(guò)程或環(huán)境問(wèn)題。
2、指示劑驗(yàn)證
對(duì)高壓滅菌效果，可在滅菌鍋內(nèi)放置芽孢指示劑（如
嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子），滅菌后培養(yǎng)觀(guān)察是否存活（若全部死亡，說(shuō)明滅菌徹底）。
五、特殊注意事項(xiàng)
避免“二次污染”：已滅菌的培養(yǎng)基若需分裝到培養(yǎng)皿，需在培養(yǎng)基冷卻至 50℃左右時(shí)操作（溫度過(guò)高會(huì)燙死后續(xù)接種的指示菌，過(guò)低則提前凝固），且傾倒速度適中（避免氣泡過(guò)多導(dǎo)致雜菌附著）。
及時(shí)使用：滅菌后的培養(yǎng)基需在 24 小時(shí)內(nèi)使用（尤其含維生素的培養(yǎng)基，長(zhǎng)期存放會(huì)因營(yíng)養(yǎng)降解影響效果），若需暫存，需在 4℃冰箱密封保存，且不超過(guò) 3 天。
通過(guò)嚴(yán)格控制以上操作要點(diǎn)，可最大限度降低雜菌污染風(fēng)險(xiǎn)，確保培養(yǎng)基的無(wú)菌性，為游離生物素的準(zhǔn)確測(cè)定提供基礎(chǔ)。
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