布氏乳桿菌的分離方法和鑒定方法及操作流程總結(jié)！
小楊 / 2025-08-18 09:26:39
布氏乳桿菌的分離和鑒定是研究其生物學(xué)特性及應(yīng)用的基礎(chǔ)，過(guò)程需結(jié)合微生物分離培養(yǎng)技術(shù)與現(xiàn)代分子生物學(xué)方法。以下是具體的分離和鑒定方法：
一、分離方法
分離的核心是從樣品（如青貯飼料、發(fā)酵食品、腸道內(nèi)容物等）中篩選出布氏乳桿菌，排除其他雜菌干擾。
1、樣品預(yù)處理
稱取一定量樣品（如 10g 青貯飼料），加入 90mL 無(wú)菌生理鹽水或磷酸緩沖液（PBS），充分振蕩制成 10?¹ 稀釋液。
采用梯度稀釋法（10?² 至 10??）進(jìn)一步稀釋，減少雜菌濃度，提高目標(biāo)菌分離效率。
2、選擇性培養(yǎng)
培養(yǎng)基選擇：
布氏乳桿菌為乳酸菌，可選用MRS 培養(yǎng)基（強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基，含葡萄糖、蛋白胨等營(yíng)養(yǎng)成分），并添加特定抑制劑（如萬(wàn)古霉素，抑制革蘭氏陰性菌）提高選擇性。
培養(yǎng)條件：因布氏乳桿菌為兼性厭氧，需在厭氧環(huán)境（如厭氧培養(yǎng)箱，通入 N?:CO?:H?=80:10:10 混合氣體）中培養(yǎng)，溫度控制在其最適生長(zhǎng)溫度（37-48℃），培養(yǎng) 24-48 小時(shí)。
3、單菌落純化
培養(yǎng)后，挑取平板上形態(tài)典型的菌落（布氏乳桿菌菌落通常為圓形、邊緣整齊、乳白色或淺黃色、表面光滑）。
采用劃線分離法在新鮮 MRS 平板上多次劃線，直至獲得純培養(yǎng)物（單菌落形態(tài)一致），并通過(guò)顯微鏡觀察確認(rèn)菌體形態(tài)均一（革蘭氏陽(yáng)性桿菌）。
二、鑒定方法
鑒定需從表型特征、生理生化特性及分子水平多維度驗(yàn)證，確保菌株準(zhǔn)確性。
（一）表型及生理生化鑒定
1、形態(tài)學(xué)觀察
革蘭氏染色：
布氏乳桿菌為革蘭氏陽(yáng)性，鏡檢呈桿狀，無(wú)芽孢，不運(yùn)動(dòng)。
菌落特征：在 MRS 平板上的菌落形態(tài)（如大小、顏色、邊緣等）可作為初步判斷依據(jù)。
2、生理生化特性測(cè)定
代謝類型：
布氏乳桿菌為異型發(fā)酵，可通過(guò)檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物（如產(chǎn)生乳酸、乙酸等）確認(rèn)（可采用高效液相色譜 HPLC 分析）。
糖發(fā)酵試驗(yàn)：利用 API 50 CH 試劑盒或糖發(fā)酵管，檢測(cè)其對(duì)葡萄糖、乳糖、蔗糖等碳水化合物的發(fā)酵能力（布氏乳桿菌通?？砂l(fā)酵葡萄糖、麥芽糖，不發(fā)酵木糖等）。
生長(zhǎng)條件驗(yàn)證：測(cè)定其在不同溫度（如 20℃、48℃、55℃）和 pH（如 pH 4.0、pH 9.6）下的生長(zhǎng)能力，符合其兼性厭氧、耐中高溫的特性。
酶活性檢測(cè)：如接觸酶試驗(yàn)陰性（不產(chǎn)生接觸酶），可與其他桿菌區(qū)分。
（二）分子生物學(xué)鑒定
分子水平鑒定是確認(rèn)菌株的金標(biāo)準(zhǔn)，基于基因序列的特異性分析。
1、16S rRNA 基因序列分析
提取菌株基因組 DNA，利用 16S rRNA 基因通用引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。
對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，將序列與 GenBank 等數(shù)據(jù)庫(kù)中已知布氏乳桿菌的 16S rRNA 基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)（如相似度≥97%，可初步判定為該種）。
2、特異性基因檢測(cè)
針對(duì)布氏乳桿菌的特有基因（如編碼乳酸脫氫酶的基因 ldh）設(shè)計(jì)引物，通過(guò) PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證，進(jìn)一步提高鑒定特異性。
3、其他分子分型方法
如脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA（RAPD）等，可用于菌株分型，區(qū)分不同來(lái)源的布氏乳桿菌菌株。
三、鑒定流程總結(jié)
樣品預(yù)處理→梯度稀釋→選擇性培養(yǎng)（MRS 培養(yǎng)基，厭氧條件）→單菌落純化；
形態(tài)學(xué)觀察（革蘭氏染色、菌落特征）→生理生化試驗(yàn)（糖發(fā)酵、代謝產(chǎn)物等）→分子生物學(xué)鑒定（16S rRNA 測(cè)序、特異性基因檢測(cè)）。
通過(guò)以上多步驟驗(yàn)證，可準(zhǔn)確分離并鑒定
布氏乳桿菌，為其后續(xù)研究和應(yīng)用（如青貯接種劑開發(fā)、益生菌篩選）提供可靠依據(jù)。
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