小鼠淋巴結(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法及具體操作步驟！
小楊 / 2025-08-23 09:16:36
小鼠淋巴結(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)是研究其生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，由于淋巴結(jié)組織中內(nèi)皮細(xì)胞比例較低（約占細(xì)胞總數(shù)的 5%-10%），且易受成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞等雜細(xì)胞污染，需通過(guò)特異性分離和純化步驟獲得高純度細(xì)胞。以下是詳細(xì)的分離與培養(yǎng)方法：
一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
1、動(dòng)物與組織
通常選用 6-8 周齡的 C57BL/6 小鼠（或根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇品系），雌雄均可。
取頸部、腋下或腹股溝淋巴結(jié)（數(shù)量越多越好，單個(gè)小鼠可獲取 3-5 個(gè)淋巴結(jié)），避免混雜脂肪和結(jié)締組織。
2、試劑與溶液
基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM/F12（1:1）或 EBM-2（內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基）。
添加劑：胎牛血清（FBS，終濃度 10%）、青霉素 - 鏈霉素（100 U/mL）、L - 谷氨酰胺（2 mM）、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ECGF，10-20 ng/mL）、肝素（50 μg/mL，抑制平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)）。
消化液：0.2% 膠原酶 Ⅰ（或 Ⅱ 型，用于解離組織）、0.05% 胰蛋白酶 - EDTA（用于分散細(xì)胞團(tuán)）。
其他：PBS（無(wú)鈣鎂）、紅細(xì)胞裂解液、無(wú)菌手術(shù)器械（眼科剪、鑷子）、培養(yǎng)皿（6 cm 或 12 孔板）、濾網(wǎng)（70 μm 和 40 μm）。
3、無(wú)菌操作環(huán)境
超凈工作臺(tái)、CO?培養(yǎng)箱（5% CO?，37℃，濕度 95%）。
二、分離步驟
1、組織收集與預(yù)處理
頸椎脫臼處死小鼠，75% 酒精浸泡消毒 3-5 分鐘。
無(wú)菌條件下解剖取淋巴結(jié)，置于含 PBS（加雙抗）的培養(yǎng)皿中，用眼科剪剔除表面脂肪和結(jié)締組織。
用 PBS 清洗淋巴結(jié) 3 次，去除殘留血液和雜質(zhì)。
2、組織解離
將淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌培養(yǎng)皿，用眼科剪剪成 1-2 mm³ 的碎塊（越碎越好，便于消化）。
加入 5-10 mL 0.2% 膠原酶 Ⅰ 溶液，37℃水浴搖床消化 30-60 分鐘（每隔 15 分鐘輕輕吹打一次，觀察組織塊是否分散）。
消化結(jié)束后，加入等體積含 10% FBS 的培養(yǎng)基終止消化，用 70 μm 濾網(wǎng)過(guò)濾，去除未消化的組織碎片，收集濾液。
3、細(xì)胞分散與純化
濾液 1500 rpm 離心 5 分鐘，棄上清，沉淀用 PBS 重懸，再次離心（重復(fù) 2 次，去除殘留膠原酶）。
若細(xì)胞中混有紅細(xì)胞，加入 1 mL 紅細(xì)胞裂解液，室溫靜置 5 分鐘，PBS 洗滌后離心。
用含添加劑的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至 1×10? cells/mL。
三、原代培養(yǎng)與純化
1、接種與初期培養(yǎng)
將細(xì)胞懸液接種至預(yù)包被明膠（0.1%）或纖維連接蛋白的培養(yǎng)皿 / 孔板中（包被可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞貼壁）。
37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 小時(shí)后更換培養(yǎng)基，去除未貼壁細(xì)胞（主要是免疫細(xì)胞等）。
2、雜細(xì)胞去除與純化
差速貼壁法：成纖維細(xì)胞貼壁速度快于內(nèi)皮細(xì)胞，可在接種后 2-4 小時(shí)輕輕吸出培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)皿，保留未貼壁的內(nèi)皮細(xì)胞（重復(fù) 1-2 次，減少成纖維細(xì)胞污染）。
選擇性培養(yǎng)基：使用含肝素和 ECGF 的內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基，抑制成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。
免疫磁珠分選（可選，提高純度）：
用抗 CD31（內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記）抗體標(biāo)記細(xì)胞，結(jié)合磁珠后通過(guò)磁分選柱，收集 CD31?細(xì)胞，純度可達(dá) 90% 以上。
3、傳代培養(yǎng)
當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到 70%-80% 時(shí)進(jìn)行傳代：
棄培養(yǎng)基，PBS 清洗 2 次，加入 0.05% 胰蛋白酶 - EDTA，37℃孵育 2-3 分鐘，鏡下觀察細(xì)胞變圓、間隙增大。
加入含 FBS 的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打使細(xì)胞脫落，離心后重懸，按 1:2 或 1:3 比例接種至新培養(yǎng)皿。
注意：原代內(nèi)皮細(xì)胞傳代次數(shù)有限（通常不超過(guò) 5-6 代），超過(guò)后易發(fā)生表型改變，建議早期凍存?zhèn)溆谩?/div>
四、細(xì)胞鑒定方法
1、形態(tài)學(xué)觀察
內(nèi)皮細(xì)胞呈典型的“鋪路石樣”形態(tài)（多邊形或短梭形，排列緊密），與成纖維細(xì)胞的長(zhǎng)梭形形態(tài)有明顯區(qū)別。
2、免疫熒光染色
檢測(cè)特異性標(biāo)記：PECAM-1，通用內(nèi)皮標(biāo)記、竇狀內(nèi)皮細(xì)胞、高內(nèi)皮微靜脈 HEVs。
陽(yáng)性細(xì)胞比例＞90% 視為純度合格。
3、功能驗(yàn)證
血管形成實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞接種至 Matrigel 基質(zhì)膠上，觀察是否形成管狀結(jié)構(gòu)（內(nèi)皮細(xì)胞特征性功能）。
五、注意事項(xiàng)
無(wú)菌操作：淋巴結(jié)組織易受污染，全程嚴(yán)格無(wú)菌，避免組織暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
消化條件：膠原酶消化時(shí)間需根據(jù)組織塊大小調(diào)整，過(guò)度消化會(huì)損傷細(xì)胞。
純化關(guān)鍵：差速貼壁和選擇性培養(yǎng)基結(jié)合可有效減少雜細(xì)胞，若需高純度，建議聯(lián)用免疫磁珠分選。
培養(yǎng)環(huán)境：保持 CO?濃度穩(wěn)定，培養(yǎng)基 pH 偏酸性（7.2-7.4），定期更換培養(yǎng)基（2-3 天一次）。
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