小鼠淋巴結內(nèi)皮細胞的分離和培養(yǎng)方法及具體操作步驟！
小楊 / 2025-08-23 09:16:36
小鼠淋巴結內(nèi)皮細胞的分離和培養(yǎng)是研究其生物學功能的基礎，由于淋巴結組織中內(nèi)皮細胞比例較低（約占細胞總數(shù)的 5%-10%），且易受成纖維細胞、免疫細胞等雜細胞污染，需通過特異性分離和純化步驟獲得高純度細胞。以下是詳細的分離與培養(yǎng)方法：
一、實驗材料準備
1、動物與組織
通常選用 6-8 周齡的 C57BL/6 小鼠（或根據(jù)實驗需求選擇品系），雌雄均可。
取頸部、腋下或腹股溝淋巴結（數(shù)量越多越好，單個小鼠可獲取 3-5 個淋巴結），避免混雜脂肪和結締組織。
2、試劑與溶液
基礎培養(yǎng)基：DMEM/F12（1:1）或 EBM-2（內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基）。
添加劑：胎牛血清（FBS，終濃度 10%）、青霉素 - 鏈霉素（100 U/mL）、L - 谷氨酰胺（2 mM）、內(nèi)皮細胞生長因子（ECGF，10-20 ng/mL）、肝素（50 μg/mL，抑制平滑肌細胞生長）。
消化液：0.2% 膠原酶 Ⅰ（或 Ⅱ 型，用于解離組織）、0.05% 胰蛋白酶 - EDTA（用于分散細胞團）。
其他：PBS（無鈣鎂）、紅細胞裂解液、無菌手術器械（眼科剪、鑷子）、培養(yǎng)皿（6 cm 或 12 孔板）、濾網(wǎng)（70 μm 和 40 μm）。
3、無菌操作環(huán)境
超凈工作臺、CO?培養(yǎng)箱（5% CO?，37℃，濕度 95%）。
二、分離步驟
1、組織收集與預處理
頸椎脫臼處死小鼠，75% 酒精浸泡消毒 3-5 分鐘。
無菌條件下解剖取淋巴結，置于含 PBS（加雙抗）的培養(yǎng)皿中，用眼科剪剔除表面脂肪和結締組織。
用 PBS 清洗淋巴結 3 次，去除殘留血液和雜質(zhì)。
2、組織解離
將淋巴結轉(zhuǎn)移至新的無菌培養(yǎng)皿，用眼科剪剪成 1-2 mm³ 的碎塊（越碎越好，便于消化）。
加入 5-10 mL 0.2% 膠原酶 Ⅰ 溶液，37℃水浴搖床消化 30-60 分鐘（每隔 15 分鐘輕輕吹打一次，觀察組織塊是否分散）。
消化結束后，加入等體積含 10% FBS 的培養(yǎng)基終止消化，用 70 μm 濾網(wǎng)過濾，去除未消化的組織碎片，收集濾液。
3、細胞分散與純化
濾液 1500 rpm 離心 5 分鐘，棄上清，沉淀用 PBS 重懸，再次離心（重復 2 次，去除殘留膠原酶）。
若細胞中混有紅細胞，加入 1 mL 紅細胞裂解液，室溫靜置 5 分鐘，PBS 洗滌后離心。
用含添加劑的完全培養(yǎng)基重懸細胞，臺盼藍染色計數(shù)，調(diào)整細胞密度至 1×10? cells/mL。
三、原代培養(yǎng)與純化
1、接種與初期培養(yǎng)
將細胞懸液接種至預包被明膠（0.1%）或纖維連接蛋白的培養(yǎng)皿 / 孔板中（包被可促進內(nèi)皮細胞貼壁）。
37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 小時后更換培養(yǎng)基，去除未貼壁細胞（主要是免疫細胞等）。
2、雜細胞去除與純化
差速貼壁法：成纖維細胞貼壁速度快于內(nèi)皮細胞，可在接種后 2-4 小時輕輕吸出培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)皿，保留未貼壁的內(nèi)皮細胞（重復 1-2 次，減少成纖維細胞污染）。
選擇性培養(yǎng)基：使用含肝素和 ECGF 的內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基，抑制成纖維細胞和平滑肌細胞生長，促進內(nèi)皮細胞增殖。
免疫磁珠分選（可選，提高純度）：
用抗 CD31（內(nèi)皮細胞特異性標記）抗體標記細胞，結合磁珠后通過磁分選柱，收集 CD31?細胞，純度可達 90% 以上。
3、傳代培養(yǎng)
當細胞融合度達到 70%-80% 時進行傳代：
棄培養(yǎng)基，PBS 清洗 2 次，加入 0.05% 胰蛋白酶 - EDTA，37℃孵育 2-3 分鐘，鏡下觀察細胞變圓、間隙增大。
加入含 FBS 的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打使細胞脫落，離心后重懸，按 1:2 或 1:3 比例接種至新培養(yǎng)皿。
注意：原代內(nèi)皮細胞傳代次數(shù)有限（通常不超過 5-6 代），超過后易發(fā)生表型改變，建議早期凍存?zhèn)溆谩?/div>
四、細胞鑒定方法
1、形態(tài)學觀察
內(nèi)皮細胞呈典型的“鋪路石樣”形態(tài)（多邊形或短梭形，排列緊密），與成纖維細胞的長梭形形態(tài)有明顯區(qū)別。
2、免疫熒光染色
檢測特異性標記：PECAM-1，通用內(nèi)皮標記、竇狀內(nèi)皮細胞、高內(nèi)皮微靜脈 HEVs。
陽性細胞比例＞90% 視為純度合格。
3、功能驗證
血管形成實驗：將細胞接種至 Matrigel 基質(zhì)膠上，觀察是否形成管狀結構（內(nèi)皮細胞特征性功能）。
五、注意事項
無菌操作：淋巴結組織易受污染，全程嚴格無菌，避免組織暴露時間過長。
消化條件：膠原酶消化時間需根據(jù)組織塊大小調(diào)整，過度消化會損傷細胞。
純化關鍵：差速貼壁和選擇性培養(yǎng)基結合可有效減少雜細胞，若需高純度，建議聯(lián)用免疫磁珠分選。
培養(yǎng)環(huán)境：保持 CO?濃度穩(wěn)定，培養(yǎng)基 pH 偏酸性（7.2-7.4），定期更換培養(yǎng)基（2-3 天一次）。
通過以上步驟，可成功分離并培養(yǎng)出高純度的
小鼠淋巴結內(nèi)皮細胞，為研究其在免疫調(diào)節(jié)、腫瘤轉(zhuǎn)移等領域的功能提供可靠的細胞模型。
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